H2滴眼液对苯扎溴铵导致的小鼠眼表损伤的预防作用△

杨雁嫦 林启 袁晴 叶蕾 朱佩文 闵幼兰 石文卿 黎彪 李清海 邵毅

干眼是目前常见的眼科疾病[1]，轻者可引起眼部症状，重者导致角膜上皮受到侵害并形成角膜新生血管等，更甚者可导致盲[2]。H2具有选择性抗氧化作用，是目前公认的没有毒副作用的最优抗氧化剂[3]，此外还具有抗炎症[4]﹑抗过敏[5]、抗凋亡[6]等作用。近年来H2对眼科疾病的治疗取得了新进展，如对白内障超声乳化手术诱导的氧化应激角膜内皮损伤的预防作用[7]，对角膜新生血管的抑制作用[8]等。那么H2对眼表会产生什么影响呢？本研究旨在探究H2滴眼液对小鼠眼表组织结构的影响，为临床治疗干眼提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物选取6～8周龄SPF级体质量(20±2)g的BALB/c雄性小鼠30只，由南昌大学医学院动物中心提供。在室温25 ℃，湿度60%及12 h明暗周期中(早上800到晚上800)饲养小鼠[9]。本研究过程对实验动物的使用和喂养均符合动物伦理学并遵循《实验动物管理条例》。

1.2苯扎溴铵滴眼液和H2滴眼液的制备将苯扎溴铵稀释于无菌PBS中，浓度为1 g·L-1，4 ℃冰箱保存备用。H2滴眼液：利用怡水科技水轻轻水素水杯，倒水50 mL并拧上机身后将其倒置，一键制氢，使氢氧完全分离，高速制氢。

1.3实验方法

1.3.1实验模型及分组将小鼠使用随机数字表法分为实验组和对照组各12只，均以右眼作为实验眼，6只不作处理作为空白对照。实验组先采取1 g·L-1苯扎溴铵滴眼液+H2滴眼液滴眼，对照组则采用1 g·L-1苯扎溴铵滴眼液与生理盐水滴眼，中间均间隔10 min，每天重复4次。在干预前及干预后1 d、7 d、14 d分别观察各组小鼠的泪膜破裂时间(tear break-up time，BUT)、基础泪液分泌试验(schirmer Ⅰ test，SⅠt)及角膜荧光素染色(fluorescent test，FL)评分，并于干预14 d后取小鼠眼球备用。

1.3.2SⅠt检测在小鼠右眼外眦中外1/3交点的地方放置酚红棉线的一端，并计时1 min。利用仪器测出红色部分的长度，换算为泪液分泌量。实验应该让同一个技师在相同的条件下(时间、地点、照明亮度、湿度及温度)进行操作[10]。

1.3.3BUT检测根据文献[9]，使用1滴荧光素钠滴眼液滴眼并瞬目，随后记录角膜染色区出现第一个破裂点的时间。实验应该让同一技师在相同的条件下(时间、地点、照明亮度、湿度及温度)进行操作。

1.3.4FL评分FL评分参考文献[11]，目的是观察小鼠角膜上皮的缺损程度。实验由同一技师在相同的条件下进行操作。

1.3.5电子显微镜下观察角膜上皮细胞将两组小鼠右眼球置于体积分数2.5%的戊二醛内2～4 h，10 g·L-1锇酸固定1～2 h；梯度乙醇脱水，环氧树脂浸透、修块，枸橼酸铅和醋酸双氧铀双染，并在电镜下观察角膜上皮细胞的结构。

1.4统计学方法利用SPSS 17.0统计软件对数据进行处理，采用χ2检验计数资料；各组计量指标比较采用t检验及Dunnett检验，α=0.05。

2结果

2.1实验组与对照组干预前后各指标评定结果干预1 d后，对照组和实验组SⅠt与干预前相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；两组SⅠt相比，差异亦无统计学意义(P>0.05)；干预7 d、14 d后，实验组SⅠt与干预前相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，而对照组SⅠt与干预前相比明显减小，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；两组SⅠt相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，实验组SⅠt均大于对照组。见表1。

表1干预前和干预后各时段两组SⅠt比较

注：与实验组相比，*P<0.05；与干预前相比，#P< 0.05

干预1 d后，对照组和实验组BUT与干预前相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；两组BUT相比，差异亦无统计学意义(P>0.05)；干预7 d、14 d后，实验组BUT与干预前相比无明显变化，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，而对照组与干预前相比明显减小，差异均有统计学意义(均为P<0.05)；两组BUT相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，实验组BUT均长于对照组。见表2。

表2干预前和干预后各时段两组BUT情况

注：与实验组相比，*P<0.05；与干预前相比，#P< 0.05

实验组干预1～14 d角膜变化不明显(图1A至D)，对照组干预1～14 d后角膜FL染色区域增加(图1E至H)。采用重复测量数据的方差分析不同时间点间实验组与对照组干预前和干预1 d、7 d和14 d后FL评分有差异(P=0.025)；实验组与对照组FL评分有差异(P=0.009)，对照组较实验组角膜上皮破坏明显。实验组与对照组的FL评分变化趋势也有明显差异(F=8.552，P=0.007)。干预后 4 d 和 7 d，两组FL评分差异均有统计学意义(均为P<0.05)，对照组均高于实验组。见表3。

表3干预后各时段两组FL评分情况

注：与实验组相比，*P< 0.05

图1两组小鼠干预1 d、7 d和14 d 后FL染色情况。A：实验组滴眼前，角膜荧光染色呈阴性；B：实验组滴眼1 d，角膜可见极少量点状染色；C：实验组滴眼7 d，角膜可见少量点状染色；D：实验组滴眼14 d，角膜仍可见少量点状染色；E：对照组滴眼前，角膜荧光染色呈阴性；F：对照组滴眼1 d，角膜可见极少量点状染色；G：对照组滴眼7 d，角膜可见较多的点状染色；H：对照组滴眼14 d，角膜可见部分区域大片状染色

2.2电镜下角膜上皮细胞结构改变在低倍电镜下观察，实验组角膜上皮细胞为多角形，细胞边缘较直，表面可见密集排列的微绒毛和微皱襞；而对照组角膜上皮细胞表面不规则，存在表层上皮细胞脱落的情况，表面微绒毛、微皱襞部分平坦或出现融合、缺失。见图2。

3讨论

干眼是较为常见的眼科疾病，是一种由于泪液的异常而引起的眼部不适症状。目前干眼的主要治疗方法包括眼睑清洁、泪液补充、抗炎治疗及手术等[12]，对干眼的诊治还没有统一标准。近年来，研究显示，H2具有抗氧化性[3]、抗炎症[4]、抗过敏[5]、抗凋亡[6]等作用。一方面与羟自由基(OH-)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)反应发挥选择性抗氧化作用；另一方面通过调控炎症因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等起到抗炎作用。在本实验中，实验组采用 1 g·L-1苯扎溴铵滴眼液和H2滴眼液滴眼，对照组采用1 g·L-1苯扎溴铵滴眼液和生理盐水滴眼，均间隔10 min，每天4次。连续给药14 d；数据分析后发现，用H2滴眼液干预7 d、14 d后，对照组SⅠt、BUT、FL评分较干预前明显恶化，而实验组无明显变化。实验组干预1～14 d角膜变化不明显且细胞超微结构无明显变化；对照组整个FL染色区域明显增加，呈点片状着染，角膜上皮细胞表面可见表层细胞部分脱落。一项临床调查显示，使用含苯扎溴铵滴眼液的患者，干眼症患病率高，且随着滴眼剂用量的增加，患病率也增加[13]。

图2两组角膜上皮细胞超微结构情况。A：实验组角膜上皮细胞呈多角形，细胞边缘较直；B：对照组角膜上皮细胞表面可见表层细胞部分脱落

此外它还会对眼表面组织和细胞有不同程度损伤[14]，这些实验均与我们的实验结果有着很大的相似性。而在应用H2后，实验组眼表的相关指标有了明显好转，说明H2滴眼液能维持泪膜的稳定性和小鼠角膜上皮的完整性，对干眼起到一定的预防作用。

对于干眼，长期性的激素类药物治疗可导致眼压升高、机会性感染、角膜穿孔等，同时还增加了罹患并发症的几率。而H2的获取方便且价格低廉，对人体无明显毒副作用，为干眼的治疗提供了一种崭新的策略。