不同年龄段人视网膜色素上皮细胞氧化应激过程中一氧化氮的水平分析△

吉智 刘旭 王霞 何媛 闫菊娥

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞和视网膜神经退行性变造成的一种不可逆性视力下降或丧失的疾病，在西方国家已成为首位致盲性眼病，在亚洲其发病率亦呈逐渐增多的趋势[1]。目前关于AMD发病机制并不十分清楚，因此缺乏有效治疗方法[2]。近年来，有关脉络膜血流量异常能促进AMD发展的假说被提出[3-5]。而一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种具有多种生理功能的强力血管扩张剂，是眼球血流的重要调节因子。有研究表明，AMD患者的NO血浆水平的变化可能与脉络膜灌注的调节有关[6]。此外，在AMD患者的眼中发现NO合酶亚型的水平显著降低[7]。所有这些发现都提示NO可能与AMD视网膜神经变性和脉络膜血流动力学改变有关。

在许多神经退行性疾病中，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-deriverd factor，PEDF)被广泛地证明是一种神经保护因子。PEDF是具有强神经营养作用糖蛋白，我们之前的研究证实[8]PEDF通过稳定线粒体网络和功能，促进衰老RPE细胞对氧化应激的恢复力。基于此，为探讨不同年龄段人RPE细胞氧化应激过程中NO释放水平以及PEDF对不同年龄段人RPE细胞中NO释放的影响，本研究建立了不同年龄段人RPE氧化损伤模型，并检测了不同年龄段及PEDF干预下人RPE细胞中NO的释放水平、氧化损伤下不同年龄段人RPE细胞中NO的释放水平。

1材料与方法

1.1材料原代人RPE细胞(来源于9～20岁，50～55岁，60～70岁，>70岁人群)由美国宾夕法尼亚大学和威斯康星大学Joyce Tombran-Tink博士赠予。DMEM/F12培养基和胎牛血清购买于美国Gibco公司，NO检测试剂盒购自美国Sigma公司，胰蛋白酶购于美国Gibco公司，H2O2、青霉素/链霉素和磷酸盐缓冲盐水(fetal bovine serum，PBS)购于中国西安依科生物技术有限公司。胰蛋白酶消化液已过滤灭菌，可直接用于细胞培养消化。将体积分数为30%H2O2用DMEM培养基稀释至300 μmol·L-1。PEDF购自美国PEPROTECH公司。将PEDF溶解在1×PBS补充物中，并在使用中用培养基稀释到250 μg·L-1。

1.2RPE细胞培养及处理使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基于体积分数5%CO2、37 ℃的培养箱(Thermo，美国)培养RPE细胞，分别接种于12 孔培养板中。每周换液两次，待细胞达到80%以上融合时，用胰蛋白酶消化传代RPE细胞，通过光镜(Nikon，日本)、扫描电镜(飞利浦，德国)及免疫组织化学进行鉴定[9-10]。将培养的原代细胞分为四组进行实验，分别为不加任何物质干预的阴性对照组，单独加300 μmol·L-1 H2O2氧化损伤组处理2 h，为H2O2氧化损伤组，单独加250 μg·L-1PEDF处理48 h为PEDF处理保护组以及同时加入250 μg·L-1PEDF+300 μmol·L-1 H2O2的损伤保护组，处理12 h，随后用NO检测试剂盒对各组细胞NO水平进行检测。

1.3不同年龄段RPE细胞内NO水平测定取出NO试剂盒中Griess试剂Ⅰ和Ⅱ，恢复至室温。使用培养基稀释检测试剂(1～100 μmol)。按每孔50 μL，在96孔板中加入检测试剂及细胞。按每孔50 μL，在各孔中加入室温Griess试剂Ⅰ和Ⅱ。应用酶标仪(Thermo，美国)测定波长为540 nm处的吸光度(A)值。确定样品中NO的浓度。

1.4统计学方法所有结果采用统计学软件SPSS 18.0进行分析。所有实验均重复3次以上。所有数据均用均数±标准差表示，组间差异的显著性分析采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同年龄段人RPE细胞的体外培养结果细胞接种后，经过2 d的体外静止适应期后，RPE细胞开始不断分裂增殖，倒置相差显微镜观察可见细胞贴壁，这些贴壁细胞呈扁平不规则多角形，大小不均，细胞透亮，可见清晰透明的圆形细胞核以及双核细胞。胞浆内含丰富黑色素颗粒，迅速分裂繁殖，5～7 d细胞基本单层融合(图1)。阴性对照组中不同年龄段人RPE细胞的形态稍有差别，年龄越小，细胞状态越饱满。PEDF处理保护组中细胞形态与阴性对照组无明显差异。H2O2氧化损伤组中各年龄段细胞均受到损伤，相邻细胞发生粘连，细胞皱缩加重，死亡及悬浮细胞增多。而加入PEDF处理后，损伤保护组中细胞形态较H2O2氧化损伤组中的细胞胞质更加饱满，死亡细胞数量显著减少。

2.2细胞内NO水平测定结果应用酶标仪检测未做任何处理的细胞内NO释放量，结果显示，随着年龄的增长，阴性对照组中50～55岁，60～70岁，>70 岁RPE细胞内NO的释放水平分别是9～20岁年龄段的1.37倍、1.25倍、1.62倍，但差异无统计学意义(9～20岁与>70岁：P=0.231)。H2O2氧化损伤组9～20岁，50～55岁，60～70岁，>70岁RPE细胞内NO的释放水平分别是阴性对照组的1.35倍、1.15倍、0.98倍及1.05倍，NO的释放量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。同时，对NO在H2O2刺激后的差值与年龄进行线性回归分析，结果显示无显著相关性(r=1.730)。不同年龄段RPE细胞经过250 μg·L-1PEDF处理后，细胞形态及数量虽有好转，但NO的释放水平结果显示，PEDF处理保护组9～20岁、50～55岁、60～70岁、>70岁RPE细胞内NO的释放水平分别是阴性对照组的1.17倍、1.10倍、1.04倍及0.96倍，NO的释放量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

图1不同年龄段及H2O2、PEDF处理后人RPE细胞的形态(倒置相差显微镜下观察)

3讨论

RPE被广泛认为是探讨AMD发病机制的支点，并广泛应用于眼科的体外研究。此外，用于诱导氧化损伤的H2O2浓度在公认的氧化损伤模型的范围内。本研究结果显示未做任何处理的细胞内NO释放水平没有明显变化，H2O2对各组细胞中NO的产生无明显影响。可能原因如下：一方面，NO是一种重要的信号分子，它作用于多种组织，调节多种生理和细胞过程，包括神经传导、免疫防御、细胞凋亡和细胞运动[11]。由于内皮细胞释放的NO参与眼球血流调控，其对血管张力系统和眼血流的调节都有着重要作用。内皮功能障碍时降低了NO的生物利用度，增加活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的产生，损害了眼球血流动力学[11]。有证据显示，AMD患者的脉络膜血流是受损的[12]。在衰老过程中，ROS和抗氧化物之间的平衡会受到破坏，从而导致细胞与组织的氧化损伤。而NO在组织中的合成和降解也是一种动态平衡，ROS可迅速灭活NO。在正常的生理条件下，内生防御系统对抗氧化，维持NO合成与ROS降解的平衡。然而，这种微妙的平衡可能会被改变，尤其是在衰老和AMD形成的过程中，这种改变导致了NO水平的降低，从而削弱了血管的松弛功能[6]。另一方面，诱导型NO合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在炎症介质的影响下释放NO，引起神经变性和细胞凋亡，导致严重的眼部疾病[13]。Cillà等[14]发现，NO由iNOS催化L-精氨酸脱胍基而产生，对RPE细胞有较强的细胞毒性，可诱导细胞凋亡。在正常生理条件下，NO 主要通过神经元型(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)与内皮型NO合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化形成，iNOS一般未发挥作用。在病理状态下，受到缺氧、缺血或创伤刺激，iNOS 表达增多，经诱导合成释放大量NO，加重RPE损伤，促进其凋亡。本研究发现，随着年龄的增长，RPE细胞内NO水平没有明显变化，H2O2对RPE细胞中NO产生的诱导作用差异也无显著性意义，这提示我们在不同年龄段人RPE细胞中NO的两种完全相反的作用可能处于一个动态平衡中，故释放水平无明显变化。

PEDF 则为从RPE细胞内提取的神经营养物质，有研究证明PEDF通过保护RPE细胞免受局部缺血及细胞毒性引起的死亡[15]，它还对中枢神经系统(central nervous system，CNS)神经元具有保护作用，也有研究证明其可保护氧化损伤引起的视网膜神经元死亡[16]。而我们前期研究发现，PEDF保护了氧化损伤下的RPE细胞[8]，主要通过以下几个途径：(1)PEDF可以增加氧化应激损伤下的RPE细胞活性；(2)PEDF可以抑制ROS的产生来减少RPE细胞死亡；(3)PEDF可维持线粒体正常的结构和功能，通过线粒体保护途径来发挥神经保护作用，减少细胞凋亡；(4)调节参与细胞凋亡基因Bax、caspase-3和Bcl-2的表达。这些都肯定了PEDF在RPE细胞氧化损伤中的保护作用。但本研究中PEDF对RPE细胞中NO的释放无明显影响，这提示我们PEDF对RPE细胞的保护作用不通过NO途径。

综上所述，NO一方面参与了视网膜血供系统的调节，舒张了血管；另一方面又参与了RPE细胞氧化损伤病理过程，是诱导RPE细胞凋亡的重要原因。由于这两种完全不同的作用，人们在制定治疗策略时可能会遇到困难，是采取对NO的补充或是对NO合酶抑制的治疗方案？而采用PEDF 干预的确可以保护RPE细胞，但对NO的释放无明显影响。