氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1(HINT1)表达的影响△

周圆 尹悦 冯俊侨 杨敏 蔡嘉慧 吴昌睿 马乐 张玮

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是导致中老年人中心视力丧失的重要原因[1-2]。目前，全球AMD的患病率已达8.9%，且呈上升趋势，已造成巨大的社会和经济负担[3]。已有研究证实，AMD发生可能与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞慢性氧化损伤密切相关[4]。作为三联组氨酸蛋白超家族的重要成员，三联组氨酸核苷结合蛋白1(histidine triad nucleotide binding protein 1，HINT1)起先被认为是一种调控内源性凋亡实现肿瘤抑制的胞内蛋白[5]。新近研究显示，老年HINT1基因敲除鼠相比同品系青年鼠，表现为焦虑样、抑郁样行为增多，认知水平下降，提示其与衰老相关，可能参与多种退行性疾病的发生[6-7]。已有研究发现，在氧化损伤发生时RPE细胞形态呈明显早衰征象，并最终出现凋亡和坏死，提示HINT1可能参与氧化损伤诱导的RPE细胞凋亡，进而参与AMD的发病过程[8]。本实验以不同浓度过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)处理RPE细胞作为研究对象，通过观察细胞活力和增殖情况判定RPE细胞氧化损伤的程度，从而确定合适的H2O2浓度；检测BAX和BCL-2蛋白表达量的变化，判定机体内凋亡水平；检测RPE细胞中HINT1蛋白表达量变化，以明确HINT1在RPE细胞氧化损伤中的作用，为深入研究AMD的发病机制及寻找潜在药物作用靶点提供参考依据。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器人ARPE-19细胞(美国模式菌种收集中心，ATCC)，H2O2(Sigma，美国)，改良型RPMI-1640培养液(HyClone，美国)，胎牛血清(HyClone，美国)，青链霉素混合液(含青霉素10×106U·L-1、链霉素10×103mg·L-1；Solarbio公司，美国)，2.5 g·L-1胰蛋白酶溶液(Solarbio公司，美国)，LIVE/DEAD Viability Cytotoxicity 试剂盒(Probes公司，美国)，BAX单克隆抗体(Cat.AF0120，Affinity Biosciences，美国)，BCL-2单克隆抗体(Cat.AF6319，Affinity Biosciences，美国)，HINT1单克隆抗体(Cat.ab124912，Abcam，美国)，β-actin单克隆抗体(Cat.C4，Santa Cruz Biotech，美国)等。

1.2方法

1.2.1RPE细胞培养人ARPE-19细胞复苏后，加入RPMI-1640细胞完全培养液(含体积分数10%胎牛血清及10 g·L-1青链霉素混合液)，置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中常规培养，第2天换液。根据细胞生长速度以12比例传代继续培养。待细胞生长至对数生长期，即细胞生长至80%融合时用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化，室温下以800 r·min-1离心5 min，收集细胞并进行细胞计数；在细胞培养板上以7×106个·L-1的密度接种对数生长期RPE细胞，培养24 h后细胞贴壁生长至 80%～90%融合。

1.2.2氧化损伤模型的建立分别对RPE细胞予以不同浓度的H2O2处理。加入含H2O2的RPMI-1640细胞培养液，调节H2O2的终浓度分别为0 μmol·L-1(对照组)、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1和600 μmol·L-1(共计6组)，然后置于相同环境中培养6 h，弃上清液，PBS冲洗3次终止。

1.2.3LIVE/DEAD双荧光染色法检测细胞活力按LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity试剂盒说明书操作。加入染料工作液，荧光显微镜下观察细胞荧光，随机选取10个视野(×200)，计数其中呈绿色荧光的活细胞和呈红色荧光的死细胞数目，计算6组细胞的死亡率。

1.2.4MTT法检测细胞活力RPE细胞以每孔 7×103个接种于96 孔板，贴壁后给予不同浓度梯度H2O2干预6 h，之后每孔避光加入20 μL的5 g·L-1MTT溶液，原培养箱中培养4 h。培养结束后小心弃去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，用多功能酶标仪于492 nm波长处测出每孔吸光度(A)值。每组设定5个复孔，实验重复3次取平均值，计算各组细胞生存率。

1.2.5Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2、HINT1的表达使用RIPA裂解液提取总蛋白。蛋白上样量为每孔40 μg，以150 g·L-1SDS-PAGE分离不同分子质量的蛋白，切取含目的蛋白的胶湿转至PVDF膜上，用50 g·L-1脱脂奶粉于摇床上室温封闭膜2 h；分别加入11000稀释的兔抗人BAX抗体、兔抗人BCL-2抗体、12000稀释的兔抗人HINT1抗体、4 ℃孵育过夜；用TBST洗涤5次，每次8 min，后加入15000山羊抗兔二抗于室温孵育 1 h；ECL显色，采用Bio-Rad凝胶成像仪采集图像。得到条带用Image-lab进行灰度值分析。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，数据采用均数±标准差表示。使用单因素方差分析比较组间差异；如差异显著，采用LSD法进行组间的两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1H2O2对RPE细胞活力的影响LIVE/DEAD荧光双染色结果显示，对照组、50 μmol·L-1H2O2组、100 μmol·L-1H2O2组、200 μmol·L-1H2O2组、400 μmol·L-1H2O2组及600 μmol·L-1H2O2组RPE细胞死亡率分别(0.35±0.11)%、(2.03±0.87)%、(3.76±1.41)%、(12.17±1.26)%、(17.69±2.24)%、(25.22±0.59)%(图1)。与对照组相比，不同浓度H2O2处理组RPE细胞死亡数显著增多；RPE细胞死亡率随H2O2浓度的上升而增长，当H2O2浓度 ≥ 200 μmol·L-1时，细胞死亡率出现显著的统计学差异(P<0.05)。

图1不同浓度的H2O2对RPE细胞活力的影响(×200，标尺：50 μm)。A：对照组；B：50 μmol·L-1 H2O2 组；C：100 μmol·L-1 H2O2组；D：200 μmol·L-1 H2O2 组；E：400 μmol·L-1 H2O2组；F：600 μmol·L-1 H2O2组

2.2H2O2对RPE 细胞增殖的影响不同浓度H2O2处理6 h后，MTT 细胞增殖实验结果显示对照组、50 μmol·L-1H2O2组、100 μmol·L-1H2O2组、200 μmol·L-1H2O2组、400 μmol·L-1H2O2组及600 μmol·L-1H2O2组细胞生存率分别为(40.72±2.71)%、(37.75±0.62)%、(35.30±0.68)%、(34.10±0.74)%、(33.61±0.71)%、(31.05±1.41)%。与对照组相比，不同浓度H2O2处理组RPE细胞随着H2O2浓度的增加，细胞生存率显著下降(P<0.05)，并呈显著的剂量-效应关系。2.3H2O2对RPE细胞中凋亡相关蛋白BAX、BCL-2表达的影响H2O2处理组相比于对照组，其RPE细胞中的BAX表达上调(P<0.01)，而各组细胞中BCL-2表达下调(P<0.01)。BAX/BCL-2比值相比对照组均升高，分别升高1.85倍(50 μmol·L-1H2O2组)、2.35倍(100 μmol·L-1H2O2组)、2.86倍(200 μmol·L-1H2O2组)、3.97倍(400 μmol·L-1H2O2组)、8.50倍(600 μmol·L-1H2O2组)，表示细胞内凋亡水平升高(图2)。

2.4H2O2对RPE 细胞中HINT1表达的影响与对照组相比，不同浓度H2O2处理组HINT1表达水平随H2O2浓度增加而下降(P<0.05)，分别下降0.78倍(50 μmol·L-1H2O2组)、0.59倍(100 μmol·L-1H2O2组)、0.45倍(200 μmol·L-1H2O2组)、0.42倍(400 μmol·L-1H2O2组)、0.38倍(600 μmol·L-1H2O2组)，且呈明显的剂量依赖性(图3)。

图2不同浓度的H2O2对RPE细胞内BAX和BCL-2蛋白表达的影响(与对照组相比，**P<0.01)。A：对照组和不同浓度H2O2组RPE细胞内BAX蛋白的表达；B：对照组和不同浓度H2O2组RPE细胞内BCL-2蛋白的表达；C：对照组和不同浓度H2O2组BAX/BCL-2的比值

图3不同浓度的H2O2对RPE细胞内HINT1蛋白表达的影响 (与对照组相比，**P<0.01)

3讨论

氧化应激是导致AMD发生的重要因素。临床研究结果表明，补充抗氧化剂可延缓AMD的发生发展[9]。作为人体氧消耗最大的组织之一，视网膜特殊生理环境往往会产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)[10-11]。当ROS产生量超出机体抗氧化能力时，则会导致视网膜蛋白及核酸的损伤[12]。H2O2是一种由细胞代谢产生的非活性氧自由基，可被转化为氧化能力极强的活性羟自由基，加剧细胞的氧化损伤，因此常被用于诱导体外氧化应激[12]。以往研究结果表明，H2O2在短时间内可诱导RPE细胞出现周期暂停、增殖停滞[10，13-14]。与以往研究相似，本研究结果显示，50～600 μmol·L-1H2O2处理RPE细胞可导致不同程度的细胞活力下降及增殖能力减弱。有研究表明，H2O2对RPE细胞的影响与作用时间相关，Marazita等[8]用H2O2处理RPE细胞72 h，细胞衰老相关β-半乳糖苷酶和细胞周期抑制基因p16、p21表达明显增多，且产生DNA损伤产物，出现细胞早衰表型，提示RPE细胞衰老、功能失调及丢失可能是AMD发生的早期事件[15-16]。

目前对于H2O2致RPE细胞死亡的具体机制尚不清楚，可能与凋亡或坏死有关[12]。Barak等[17]对暴露于不同浓度H2O2的RPE细胞凋亡和坏死情况进行检测发现，低浓度 H2O2主要导致RPE细胞凋亡，而高浓度H2O2主要导致细胞坏死。Kim等[18]提出H2O2诱导的RPE细胞死亡机制可能是凋亡和坏死两者兼有，且与H2O2剂量有关。作为凋亡发生的重要信号，ROS可诱导氧化应激，从而激活细胞凋亡内源性信号通路。这一内源性的信号通路通常被线粒体中的抗凋亡蛋白BCL-2以及促凋亡蛋白BAX所调节[18]。本研究对凋亡蛋白家族中重要蛋白BAX和BCL-2进行分析后发现，BAX表达上调而BCL-2表达下调，其BAX/BCL-2比值显著上升，提示H2O2处理后RPE细胞内凋亡途径启动，与以往研究结果基本一致[19-20]。

作为一种年龄相关的退行性眼病，AMD具有众多与阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)等退行性疾病相似的病理特征，如β淀粉样蛋白沉积，且与AD共享相似的遗传背景[21]。已有资料显示，AMD患者Wnt-β-catenin通路中关键分子表达上调。作为Wnt通路的间接抑制剂，HINT1表达下调可导致Wnt通路激活，诱导AMD的发生[22-23]。以往研究对出现AD样行为倭狐猴大脑测序，发现与青年倭狐猴相比，随着机体衰老，老年倭狐猴HINT1表达下降[24]。HINT1可能是反映机体发生退行性改变的关键分子，也提示HINT1可能影响RPE细胞损伤过程，参与AMD的发生。此外，以往研究表明，HINT1与内源性凋亡途径关系密切，可通过调控内源性凋亡途径参与AMD的发生[25]。本研究结果显示，H2O2氧化损伤RPE细胞后 HINT1的表达呈剂量依赖性下降，提示HINT1对RPE细胞可能具有潜在的保护作用，从而延缓AMD的发生发展。

本研究结果显示，H2O2氧化损伤将通过抑制HINT1表达引起凋亡发生，诱导RPE细胞的衰老及生长停滞。本研究为验证HINT1作为AMD潜在治疗靶点提供了一定的参考依据。