碱性过氧化氢预处理小麦秸秆强化酶解产糖的研究

苗林平 ， 霍 丽 ， 徐 力 ， 周瑞佳 ， 杨明琰 ,2*， 樊 成

（1. 长安大学 环境科学与工程学院，陕西 西安 710054；2. 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西 西安 710054；3. 陕西省产品质量检验监督研究院，陕西 西安 710048）

面对日益枯竭的能源问题，发展生物质能源是解决该问题的重要途径。木质纤维素资源是地球上现存量最大的生物质资源，可作为生物乙醇生产的重要来源[1-2]。农作物秸秆是木质纤维素原料的重要来源。我国是一个农业大国，秸秆资源年产量近7.284×104万t，而每年焚烧处理量超出50%，这不仅导致环境污染，还造成资源的严重浪费[3-4]。因此，利用工业技术和生物质生产将木质纤维原料中的糖类和芳香族化合物转化为化工产品，对发展新能源、保护环境意义重大[5]。

木质纤维原料主要组份是纤维素、半纤维素及木质素，其生物转化工艺包括预处理、酶解和发酵[6]。而预处理又最为关键，其目的是分离或除去包裹在纤维素表面的木质素、半纤维素，破坏纤维内部的氢键和葡萄糖单元之间的β-1,4-糖苷键，改变晶体形态，降低聚合度，增大原料的比表面积和孔隙率[7]，从而提高酶解效率。现如今常用的处理方法分物理法、化学法、生物法、物化耦合法[8]。其中化学法中的碱处理因为处理条件温和，不易产生酶解抑制物等优点而研究较多，并且在碱性条件下加入O3、过氧化氢类氧化剂除了能强化脱除木质素，改善产品色泽，还可以作为半纤维素的温和增溶剂，促进半纤维素的溶出[9]。

本文在温和条件下用碱性过氧化氢处理小麦秸秆，分别研究了过氧化氢浓度、处理温度、处理时间对原料化学成分及酶解效率的影响，确定其最佳预处理条件；对预处理后的样品进行了SEM和 FT-IR表征，分析预处理对原料形貌及官能团变化的影响。

1 实验

1.1 原料与试剂

小麦秸秆采自陕西省长安县，经过清洗，除去混杂的杂草泥沙，自然风干，粉碎，过 10目筛，放入塑封袋中置于干燥器中备用。

氢氧化钠，过氧化氢，冰乙酸，间苯三酚，浓硫酸，浓盐酸，均为分析纯。

Cellic® CTec2（abbreviated CTec2），由Novozymes诺维信中国公司提供，酶活性147 FPU/mL。

1.2 主要仪器

紫外分光光度计-752N，上海仪电分析仪器有限公司；SBA-40E生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；SEM-扫描电镜，Hitachi S-3700，苏州佐藤精密仪器有限公司；FT-IR傅氏转换红外线光谱分析仪，厦门市安奈特科贸有限公司。

1.3 预处理方法

称取5.0 g绝干备好的小麦秸秆物料，按固液比为1∶10加入质量分数为2.0%氢氧化钠（实际混合后浓度为1.0%）和预设条件于恒温，转速120 r/min的摇床中处理一定时间。对处理样品进行抽滤，将滤渣用去离子水洗涤至中性，自然抽干控制含干量约10%～20%，计算绝干质量和失重率。取样检测滤渣中三素含量。

1.3.1过氧化氢浓度对原料化学成分的影响

恒温25℃，氢氧化钠质量分数为2.0%的碱性环境，H2O2质量分数分别为（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）7个水平条件下按“1.3”进行预处理24 h，再将预处理的样品按“1.4”进行酶解72 h。

1.3.2预处理温度对小麦秸秆化学成分的影响

分别设定处理温度为 20、30、40、50、60℃氢氧化钠质量分数为2.0%的碱性环境，H2O2质量分数固定为2.0%，按“1.3”进行预处理2 h，再将预处理的样品按“1.4”进行酶解72 h。

1.3.3预处理时间对小麦秸秆化学成分的影响

恒定处理温度为30℃，氢氧化钠质量分数为2.0% 的碱性环境，H2O2质量分数固定为2.0%，分别设定处理时间为0、4、8、12、24、48 h，按“1.3”进行预处理，再将预处理的样品按“1.4”进行酶解72 h。

1.4 酶解方法

分别称取未处理和处理后1 g绝干样品于100 mL具塞三角瓶中，加入pH5.5，50 mmol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，使固含量为2.0%，并按0.5 g/L 加入抗生素，再加入纤维素酶15 FPU/g葡萄糖，混合摇匀后置于温度为50℃，恒温振荡器中的转速为180 r/min进行酶解实验。定时取样（4、8、12、24、48、72 h），以13 000 r/min速度离心，取其上清液用SBA-40E生物传感分析仪测定葡萄糖含量，并计算酶水解效率（SED，substrate enzymatic digestibility）。其公式如式（1）所示。

式中：SED为酶水解效率，%；Cglu是酶解液中葡萄糖的浓度，g/L；V是酶解液的体积，L；W是样品的绝干重量，g；Mglu是样品中纤维素含量，%。

1.5 三素分析方法

麦秆中三素含量测定方法采用NERL两步酸水解法[10]。称取干燥恒重0.300 0 g的绝干物料加入10 mL试管中，做平行样三组，再加入3.00 mL浓度为72%硫酸，搅拌均匀使其充分混合后置于30℃的恒温水浴中保温60 min，每5～10 min取出试管摇匀；取出试管分批次慢慢加入84 mL去离子水转移至100 mL三角瓶中，使酸浓度稀释到4%，塞紧塞子，摇匀，在灭菌锅中121℃，1 h，取出自然冷却瓶体。酸水解物料后使用G3砂芯漏斗真空过滤后，滤液用来测定其中葡萄糖和木糖含量，其中葡萄糖含量采用SBA-40E生物传感分析仪测定，木糖含量采用分光光度法，滤渣用来测定木素含量。

1.6 预处理材料表征分析

1.6.1扫描电镜分析

分别取少量原料及预处理样品，经冷冻干燥后，用导电双面胶将其固定在扫描电镜的样品台上，并进行喷金处理。分别在500及2 000倍下观察并拍摄具有代表性的形貌。

1.6.2傅里叶变换红外光谱分析

KBr 磨成粉末状后压片测得其基底，再分别取微量样品放入研钵中，与KBr一起研磨，使样品与KBr充分混合，然后取少量粉末放在磨具上压成薄片，使用MA GNA2IR750型傅里叶红外光谱仪进行红外光谱扫描后去除基底得到红外光谱图，分析产物的官能团的变化。

2 结果与讨论

2.1 过氧化氢浓度对麦秆化学成分及酶解糖化率的影响

小麦秸秆中含有纤维素 34.10%±1.54%、半纤维素 24.98%±1.82%、木质素 23.04%±2.45%、其它17.88%±1.98 %（含灰分7.11%±2.33 %）。在2% NaOH碱性条件下，采用不同质量分数H2O2预处理24 h，麦秆化学成分的变化及酶解结果如图1所示。

由图1可知，在碱性条件下，随着过氧化氢浓度的增加，样品纤维素含量有一定增加，半纤维素及木质素含量均有显著下降。随着H2O2的质量分数提高至2%，半纤维素脱除率达到40.09%，木质素脱除率达到47.63%，之后其脱除率减缓。在碱性过氧化氢处理条件下，氢氧根离子能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化（碱与酯生成醇和羧酸盐）半纤维素和木质素之间的酯键，促进半纤维素和木质素的溶出[7-9]。同时过氧化氢在碱性条件下电离成的过氧氢根离子，具有强氧化作用，会与木质素结构中的侧链和苯环氧化后的发色基团反应。通过和对侧链发生烷基化亲核反应，在侧链上形成不稳定的共振杂化体，使木质素的共扼侧链发生氧化断裂，增强了反应产物的亲水性。并且反应过程也会改变它的骨架。木质素的一些发色基团如亚甲基型、醌型还有比如共扼羰基和羰基发生开环反应，生成亲水性的羧基和羟基，促进木质素溶解，从而降低处理后的小麦秸秆中木质素含量[11-12]。由酶解率SED的变化可知，随着过氧化氢浓度增加，SED显著提高，在过氧化氢浓度为2.0%时，SED由对照组的70.32% 提高至92.96%，此后酶解率趋于平缓。综合滤渣三素含量及酶解率的变化，过氧化氢浓度过高，虽然能脱除更多的半纤维素及木质素，但也会造成一定的纤维素的损失。因此，确定过氧化氢浓度为2.0%为合适的浓度。

图1 过氧化氢浓度对麦秆化学成分 及酶解效率SED的影响

图2 过氧化氢作用时间对麦秆化学成分 及酶解效率SED的影响

2.2 预处时间对麦秆化学成分及酶解率的影响

处理温度为30℃，质量分数为2.0% NaOH和质量分数为2.0% H2O2，分别预处理0、4、8、12、24、36 h。麦秆化学成分的变化及酶解情况如图2所示。

图2表明在处理时间小于12 h时，秸秆化学成分变化明显，木质素和半纤维素脱除率依次逐渐增大，酶解率也依次增加。当处理时间大于12 h后，变化趋势减缓，在24 h之后几乎就无明显变化。而酶解效率SED也在处理时间为24 h达到93.19%，继续增加处理时间，酶解效率增加不大。综合酶解率及纤维素损失等因素，24 h为最佳处理时间。

2.3 预处理温度的探究

取干重原料5.0 g，处理时间为24 h，质量分数为2.0% NaOH和质量分数为2.0% H2O2，分别设定温度为20、30、40、50、60℃进行预处理，麦秆化学成分的变化及酶解情况如图3所示。

对照不同温度处理结果可知，在处理温度范围内，温度对原料中纤维素和半纤维素的影响较小，对木质素成分影响较大。20～30℃之间样品中木质素含量随温度升高降低。当处理温度30℃时，样品中木质素的含量为16.36%，木质素脱除率为48.66%，半纤维素含量为18.81%，半纤维素脱除率为41.81%，样品中纤维素含量为50.43%，纤维素保留率为89.52%，温度上升至40℃时，木质素的含量基本不变；当温度继续升高时，木质素含量反而有所增加，主要是随着温度的升高，会增加过氧化氢的热不稳定性，从而减少木质素的脱除。余勇中等[13]提到，在预处理中加入微量硅酸镁、硅酸钠或者沸石做稳定剂，可以钝化秸秆中的 Fe、Cu、Mn离子的活性，从而有效的降低过氧化氢无效分解。样品SED随温度的变化曲线表明，酶解率先随温度升高呈现先升后降的趋势，与样品中木质素的含量呈现相同的变化规律。考虑到增加温度会增加能耗，因此预处理温度选定在30℃。

图3 过氧化氢作用温度对麦秆化学成分 及酶解效率SED的影响

图4 酶解时间对酶解率的影响

2.4酶解时间对酶解效率SED的影响

取处理时间为24 h、质量分数为2.0% NaOH和质量分数为2.0% H2O2，在温度为30℃进行预处理后的滤渣进行酶解，分别在4、8、12、16、24、32、48、72 h取样测糖含量，并设置原料直接酶解作为对照。酶解结果如图4所示。

由图4可知，原料及预处理样品的SED均随酶解时间的增加而增加，其中预处理样品的SED随着时间的延长迅速上升，至32 h时酶解率达到85.41%，此后酶解率上升减缓，至48 h达到最大酶解率94.18%；原料的酶解率远远低于预处理样品，72 h时酶解率仅为19.53%，说明碱性过氧化氢预处理对提高纤维素的酶解率是十分有效的。

2.5 表征分析

2.5.1预处理小麦秸秆SEM表征分析

为了进一步研究预处理后物料化学成分、酶解效率（SED）与结构特征之间的关系，采用 SEM 观察原料和预预处理样品的结构变化。

图5 小麦秸秆原料及预处理样品SEM图

图5为小麦秸秆原料（A、B）和碱性过氧化氢预处理后（a、b）后电镜扫描图。从图5可以看出，未处理的秸秆原料具有比较光滑并且紧密的表面形态，表面结构基本完整；经过碱性过氧化氢预处理后，秸秆表面形态与原料完全不同，结构明显被破坏，表面十分粗糙，出现大量的折皱和孔洞，主要原因是在预处理过程中原料在碱性条件下充分润胀。原本包裹在纤维素表面的半纤维素和木质素被大量脱出，使得纤维素外露，底物的可及性提高，比表面积和孔隙率增大，这种结构的变化对于后续的酶解有积极的影响。

2.5.2预处理小麦秸秆傅里叶变换红外光谱分析

预处理会改变生物质的化学结构和官能团，采用FT-IR光谱技术检测预处理后生物质成分的化学结构和功能基团的变化，结果如图6所示。纤维素是由D-葡萄糖单元以β-1,4糖苷键构成的直链高分子聚合物，在 C2、C3、C6上都有一个自由羟基，其红外敏感基团是 β-葡萄糖苷键；半纤维素是由多种单糖组成的复合聚糖，其红外敏感基团是乙酰基和羟基；芳香族高分子化合物木质素由苯环经过醚键和碳碳键连接而成，其分子中含有碳氧双键C=O、甲氧基CH3-C=O和芳环等红外敏感基团[14-15]。经过预处理后，由于其主要成分的变化，会使红外图谱发生相应的改变。

图6 小麦秸秆原料及预处理样品红外光谱图

由图6可以看出，在897 cm-1波段处，样品中的纤维素 C-H 弯曲振动特征吸收峰明显高于原料，表明经碱性过氧化氢预处理后样品中的纤维素得到了富集；预处理后的样品在1736 cm-1的峰基本消失，在1245 cm-1的吸收峰明显减弱，表明碱性过氧化氢处理可以断裂半纤维素和木质素之间形成的酯键和醚键，同时脱除了大量的半纤维素和木质素；代表芳香环骨架振动的1512 cm-1吸收峰消失，表明预处理脱除了大量的木素。

3 结论

碱性过氧化氢预处理可以脱除麦秆原料中的半纤维素和木质素，使原料中的纤维素得到富集。在优化条件下，即 NaOH 和 H2O2质量分数为2.0%、处理温度为30℃、预处理时间为24 h时，所得的样品中纤维素含量可达50.43%，纤维素回收率为89.52%，半纤维素和木质素的脱除率分别为41.81%和48.66%。将处理后样品进行酶解，其酶解率可提高至94.18%，具有一定的生产价值。将样品进行扫描电镜和傅里叶变换红外光谱分析可知，经预处理后其形貌和官能团发生了很大的变化，这些变化与物料化学成分的变化及酶解率的提高可以互相印证。