高糖环境下不同浓度黄芪注射液对肾小管上皮细胞凋亡及NF-κB表达的影响

梅莎莎，宋恩峰，项 琼

(武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症，其病因及发病机制尚不清楚，最终会发展为终末期肾衰竭[1-2]。肾小管上皮细胞的损伤在糖尿病肾病发病早期就已经存在，可表现为结构和功能的损伤，如肾小管细胞各种炎症反应以及肾小管上皮细胞的凋亡[3]。肾小管上皮细胞的过度凋亡可导致肾小管损伤，加速肾功能衰竭。而高血糖作为独立危险因素可促进肾小管上皮细胞凋亡，激活核转录因子-κB(NF-κB)，NF-κB作为炎症介质，可激活肾脏内的一系列炎症反应，加重肾脏损害，加速糖尿病肾病的发生发展[4-5]。中药黄芪具有保护肾功能及降低血糖作用[6-7]，且笔者前期试验发现黄芪注射液能够抑制肾小管上皮细胞的过度凋亡及NF-κB的表达，对DN有保护作用[8-9]。本实验旨在探讨黄芪注射液浓度与细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达间的关系，为临床治疗DN提供依据。

1 实验资料

1.1材料 人近曲肾小管上皮细胞株(HK-2)，武汉大学人民医院肾内科实验室惠赠；黄芪注射液，哈尔滨圣泰制药股份有限公司，国药准字Z23020820；DMEM高糖培养基、DMEM低糖培养基、0.25%胰酶溶液、青-链霉素溶液、PBS，吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制品有限公司；DMSO，sigma公司；Annexin V/PI凋亡试剂盒，Clontech 公司；流式细胞仪，Becton Dickinson 公司：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天；PVDF膜，Millipore；GAPDH抗体，杭州贤至生物有限公司；NF-κBp65，Bioworlde；HRP标记羊抗兔二抗，武汉博士德生物工程有限公司；ECL底物液，Thermo；显影定影试剂盒，武汉巴菲尔生物。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人近曲肾小管上皮细胞生长于浓度为10%胎牛血清及1%双抗的DMEM低糖完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。显微镜观察细胞生长情况，2～3 d可进行传代，传代比例为1∶3，试验用第6代细胞。

1.2.2实验分组与处理 待细胞融合至80%，将培养基换成无血清DMEM低糖培养基同步化24 h后，弃去无血清培养基。将细胞分为低糖组(低糖培养基含D-葡萄糖5.5 mmol/L)、高糖组(高糖培养基含D-葡萄糖25 mmol/L)、高糖+2 μg/mL黄芪注射液组(高糖培养基+2 μg/mL黄芪注射液)、高糖+20 μg/mL黄芪注射液组(高糖培养基+20 μg/mL黄芪注射液)、高糖+200 μg/mL黄芪注射液组(高糖培养基+200 μg/mL黄芪注射液)，每组设3个复孔。于37 ℃培养箱中培养48 h、72 h(前期试验[8]表明培养48 h、72 h能明显降低凋亡率及NF-κB的表达)，收集细胞及细胞上清液用于后续试验。

1.2.3细胞凋亡率检测 每组设3个复孔，培养48 h、72 h后胰酶消化进行细胞收集，用250 μL结合缓冲液调节细胞浓度为1×105mL-1，在重悬液中依次加入5 μL Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL Propidium Iodide(PI)，混匀后避光在冰上孵育15 min。再加入400 μL 结合缓冲液后混匀，上流式细胞仪进行定量分析，每组测3次。

1.2.4NF-κB蛋白表达检测 每组设3个复孔，培养48 h、72 h后胰酶消化进行细胞收集。采用Western blot法测定。配制裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品进行凝胶电泳。电泳结束后将凝胶移入转膜缓冲液固定，转膜完毕后将膜置人含5%(W/V) 脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)中，室温下封闭1 h。加入一抗，摇床4 ℃反应过夜，用PBST洗涤3次后用封闭液稀释荧光二抗，室温下反应 30 min，用PBST洗涤后加ECL底物液，孵育数分钟。等荧光条带显示清楚后，将多余的底物液用滤纸吸出，待X胶片压片好后进行显影和定影。

2 结 果

2.1各组培养不同时间肾小管上皮细胞凋亡率比较 培养48 h和72 h，高糖组细胞凋亡率均明显高于低糖组(P均<0.05)；黄芪注射液各干预组细胞凋亡率均明显低于高糖组(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黄芪注射液组明显低于高糖+2 μg/mL黄芪注射液组和高糖+20 μg/mL黄芪注射液组(P均<0.05)，高糖+20 μg/mL黄芪注射液组明显低于高糖+2 μg/mL黄芪注射液组(P均<0.05)。见表1及图1。

2.2各组培养不同时间NF-κB蛋白表达量比较培养48 h和72 h，高糖组NF-κB蛋白表达量均明显高于低糖组(P均<0.05)；黄芪注射液各干预组NF-κB蛋白表达量均明显低于高糖组(P均<0.05)，且高糖+200 μg/mL黄芪注射液组明显低于高糖+2 μg/mL黄芪注射液组和高糖+20 μg/mL黄芪注射液组(P均<0.05)。见表2及图2和图3。

表1 各组培养不同时间肾小管上皮细胞凋亡率比较

注：①与高糖组比较，P<0.05；②与高糖+200 μg/mL黄芪注射液组 比较，P<0.05；③与高糖+20 μg/mL黄芪注射液组比较，P<0.05。

2.3高糖环境下黄芪注射液浓度、细胞凋亡率、NF-κB蛋白表达之间的相关性 细胞培养48 h、72 h，黄芪注射液浓度与细胞凋亡率呈负相关(r=-0.856,-0.889,P均<0.05),与NF-κB蛋白表达量也呈负相关(r=-0.669,-0.704,P均<0.05)；NF-κB蛋白表达量与细胞凋亡率呈正相关(r=0.828,0.765,P均<0.05)。

3 讨 论

我国糖尿病患者已经超过9 000万人，约有1/3的患者会并发DN，正威胁着人们的健康[10]。DN在中医归属“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴，以气阴两虚为本，瘀血、痰湿为标，治则应补气利水，活血化瘀。本实验通过观察黄芪注射液对肾小管上皮细胞凋亡和NF-κB蛋白表达的影响及分析三者的关系，探讨了黄芪注射液治疗DN的机制。

注：A为低糖组，B为高糖组，C为高糖+2 μg/mL黄芪注射液组，D为高糖+20 μg/mL黄芪注射液组，E为高糖+200 μg/mL黄芪注射液组

图1 各组培养48 h和72 h肾小管上皮细胞凋亡情况

表2 各组培养不同时间NF-κB蛋白表达量比较

注：①与高糖组比较，P<0.05；②与高糖+200 μg/mL黄芪注射液组比较，P<0.05；③与高糖+20 μg/mL黄芪注射液组比较，P<0.05。

图2 各组培养48 h NF-κB蛋白表达情况

图3 各组培养72 h NF-κB蛋白表达情况

在DN的发展过程中，高血糖有重要的促进作用，长期的高血糖可导致肾组织和功能损害，从而加速肾衰竭的进展。研究表明NF-κB主要以无活性形式表达于肾小管上皮细胞，但肾小管上皮细胞在高糖培养基中培养后发现NF-κB表达明显增加且活性增强[11]。此外，高血糖还可通过多途径诱导肾小管上皮细胞的凋亡[12-13]。本实验结果也表明高糖环境可促进NF-κB蛋白表达及肾小管上皮细胞凋亡。

NF-κB参与机体的各种应激、炎症反应，其与细胞凋亡有密切关系，参与多种细胞的凋亡相关基因的转录调控，对细胞凋亡有双向调节作用。在某些因素的刺激及特定的细胞中，NF-κB的活化有促进细胞凋亡的作用，该作用可能是通过抑制抗凋亡基因实现的。肾小管上皮细胞中NF-κB表达的增加与细胞凋亡是否有联系尚不明确，本实验相关性结果表明两者存在正相关，即NF-κB表达的增加可能使肾小管上皮细胞凋亡率增加，细胞凋亡发生机制可能与NF-κB相关。

黄芪注射液的主要成分是黄芪甲甙，有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿等作用，其联合其他药物治疗DN疗效显著[14]。本实验结果显示，细胞培养48h和72h，高糖组细胞凋亡率及NF-κB蛋白表达量均明显高于其他组，黄芪注射液能显著减少肾小管上皮细胞凋亡及NF-κB蛋白表达；黄芪注射液浓度与NF-κB蛋白表达及细胞凋亡率呈负相关，细胞凋亡率与NF-κB蛋白表达呈正相关。推测高糖可诱导肾小管上皮细胞中NF-κB蛋白表达增加，而NF-κB能够促进细胞凋亡，使细胞凋亡率增加，黄芪注射液可通过抑制NF-κB蛋白表达，降低细胞凋亡率，对肾小管上皮细胞起到保护作用。但黄芪注射液作为中药提取物，对DN发病机制的作用为多靶点，其具体作用机制仍不清楚，还有待进一步研究。