喉鳞状细胞癌中SIAH2表达的预后价值

刘玉东 甄娟 韩晓丽

喉癌是仅次于肺癌的第二位常见呼吸道恶性肿瘤，喉鳞状细胞癌是其最常见的组织学类型，发病率逐年递增。目前喉鳞状细胞癌的治疗以手术为主，放化疗为辅，尽管取得了较大进展，但是晚期喉鳞状细胞癌患者由于复发和转移的原因病死率仍较高，患者生存率在过去的几十年并未显著改善。临床大量数据表明，治疗早晚对患者的预后有重要影响［1-2］。因此，针对喉鳞状细胞癌的早期诊断和预后评估的研究日益重要，喉鳞状细胞癌发生及进展的促癌因子和与预后相关的新的生物学指标，在诊治和评估患者预后的同时有助于制定更科学合理的综合治疗方案。有研究［3-6］报道E3泛素连接酶SIAH2可作为癌基因参与多种恶性肿瘤的发生发展和转移。有研究［3］提示SIAH2在卵巢上皮性癌组织中的表达明显高于正常卵巢组织，与卵巢上皮性癌的组织学分级和淋巴结转移密切相关，高表达SIAH2的患者5年生存率显著降低、无瘤生存期明显缩短，SIAH2是卵巢上皮性癌患者预后的独立影响因素。然而SIAH2在喉鳞状细胞癌中的研究和作用仍然不明，鲜见此标志物与喉鳞状细胞癌预后关系的报道。本研究采用免疫组织化学和Western blot检测SIAH2在喉鳞状细胞癌中的表达，分析SIAH2与患者预后的相关性，探讨SIAH2在喉鳞状细胞癌诊治和预后判断中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2009年1月至2016年12月河北省人民医院手术切除喉标本存档蜡块119例，其中喉鳞状细胞癌57例，不典型增生32例，正常喉组织30例。所有患者术前均未接受放、化疗。57例喉鳞状细胞癌患者中男性43例，女性14例；年龄≥60岁31例，＜60岁26例；肿瘤部位：声门型27例，声门上型19例，声门下型6例，跨声门型5例；组织学分级：中高分化33例，低分化24例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期22例；淋巴结转移20例，无淋巴结转移37例。标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，H&E常规染色后明确诊断。部分标本离体后取少量立即放入液氮后-70℃冰箱保存，以备Western blot检测，其中癌旁组织为远离肿瘤至少1 cm并经病理证实为正常喉组织。所有标本的使用均通过本院伦理委员会审核且患者本人知情同意。

主要试剂：鼠抗人SIAH2抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学S-P检测试剂盒、PBS缓冲液、DAB酶底物显色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色及结果判定 组织标本经中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4 μm厚度的连续切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，按照免疫组织化学S-P检测试剂盒说明书步骤进行SIAH2（1:200）免疫组织化学染色。PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。SIAH2判定标准：SIAH2以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性显色，将阳性细胞百分比分为5级：无阳性细胞0分，≤10%1分，11%～50%2分，51%～80%3分，＞80%4分；细胞着色强度：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分。上述两分值相乘分数＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.2.2Western blot检测 收集新鲜喉组织，加入裂解液充分裂解，粉碎匀浆后，低温高速离心（4℃，12 000 r/min，40 min），提取蛋白。聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳（4%浓缩胶电压80伏，12%分离胶电压120伏），转印，封闭，抗SIAH2（1:200）、抗β-actin（1:200）4℃孵育过夜，二抗（1:6 000）室温孵育2 h，ECL发光；拍照，Image J软件用于半定量分析特异性条带的光密度值，将目的蛋白与β-actin光密度值作为相对表达量。实验至少重复3次，取平均值。

1.2.3 随访 所有喉鳞状细胞癌患者术后进行5年定期随访，开始时间为接受手术的时间，截止日期为2018年6月31日。采用门诊随访及电话随访，平均每6个月1次，规定患者死亡时间为终止时间，中途失访者（删失者）的终止时间为最后1次随访时间，亦纳入生存分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，SIAH2与喉鳞状细胞癌临床病理参数的关系采用χ2检验及Fisher's确切概率法分析，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线及Log-rank检验进行生存分析，Cox回归分析喉鳞状细胞癌患者预后的独立预测因素，定量资料采用One-Way ANOVA分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SIAH2蛋白在喉组织中表达的定性检测

免疫组织化学结果显示，SIAH2呈核表达阳性（图1），在正常喉组织、不典型增生及喉鳞状细胞癌组织中的阳性表达率逐渐升高，分别为26.67%（8/30）、53.13%（17/32）、77.19%（44/57），差异具有统计学意义（χ2=21.02，P＜0.001）。SIAH2与喉鳞状细胞癌的组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关（均P＜0.05，表1）。

图1 SIAH2在喉组织中的表达（SP×200）

2.2 SIAH2在喉组织中表达的定量检测

Western blot检测结果显示，正常喉组织、不典型增生组织及喉鳞状细胞癌组织中SIAH2的相对表达量分别为1.25±0.04、1.38±0.05、1.44±0.07；正常喉组织至不典型增生再至喉鳞状细胞癌组织中SIAH2表达量逐渐升高，差异具有统计学意义（F=61.811，P＜0.001，图2）。

表1 57例喉鳞状细胞癌组织中SIAH2表达与临床病理学参数的关系

图2 SIAH2在喉组织中的表达

2.3 生存分析

符合要求（随访时间5年）的34例患者，包括删失（中途失访者）4例，纳入生存分析。SIAH2阳性表达患者和阴性表达患者5年生存率分别为18.18%（4/22）和58.33%（7/12），SIAH2阳性表达患者总生存率显著低于阴性表达患者，差异具有统计学意义（χ2=5.720，P=0.017）。SIAH2阳性表达患者和SIAH2阴性表达患者5年平均生存时间分别为29个月和49个月，中位生存时间分别为25个月和60个月，SIAH2阳性表达患者中位生存时间低于阴性表达者，差异具有统计学意义（χ2=5.831，P=0.016，图3）。对喉鳞状细胞癌患者生存时间的单因素和多因素分析结果表明，SIAH2表达、临床分期、淋巴结转移与喉鳞状细胞癌的生存时间相关（均P＜0.05，表2），SIAH2是喉鳞状细胞癌预后的独立影响因素之一（表3）。

图3 SIAH2表达与喉鳞状细胞癌患者累积生存率关系

表2 喉鳞状细胞癌患者总生存率的单因素分析

表3 喉鳞状细胞癌患者总生存率的多因素分析

3 讨论

喉癌是严重危害人类生命和健康的常见头颈部恶性肿瘤，其中喉鳞状细胞癌占所有喉癌患者的90%以上。目前喉鳞状细胞癌的检测和预测大多基于组织学分级和TNM分期系统的研究，临床实践发现肿瘤部位、淋巴结转移、组织学分级以及临床分期等不足以准确而全面地评估患者的预后［7-9］。因此，寻求有效的肿瘤标志物对喉鳞状细胞癌的检测和预后评估具有非常重要的意义。

SIAH家族蛋白是果蝇属SINA蛋白的同系物。人类有两个高度保守同源的SINA，为SIAH1和SIAH2，是由鼠的SIAH cDNA作为探针从人胎儿脑组织克隆而出。SIAH2是一种高度保守的泛素连接酶，与SIAH1有85%的同源性，定位于3q25号染色体，编码324个氨基酸［10］。经由RING FINGER区域参与一些蛋白的泛素化和水解作用，其中SIAH2作用的底物蛋白包括EAF2［11］、Nrf2［12］、CHK2［13］、ATS2［14］等，从而影响细胞的功能如低氧反应、信号转导通路、细胞凋亡及肿瘤发生等［15］。有研究［10］发现SIAH1作为肿瘤抑制因子发挥生物学作用，尽管SIAH2与SIAH1有85%的同源性，但与SIAH1发挥的作用完全不同，SIAH2在有增殖能力的细胞中表达，而在不增殖的细胞中表达缺失。有研究报道SIAH2在卵巢癌［3］、肺癌［4］、乳腺癌［5-6］等组织中均高表达，并且随着肿瘤组织学分级和临床分期的升高其蛋白表达水平也逐渐升高。推测SIAH2是作为癌基因在多种恶性肿瘤中发挥作用。本研究定性和定量实验结果显示，在喉鳞状细胞癌组织中SIAH2蛋白的表达高于其在不典型增生组织和正常喉组织中的表达，并且与癌组织学分级、临床分期和淋巴结转移呈正相关，提示SIAH2蛋白在喉鳞状细胞癌中可能起促进作用。

有报道［3］SIAH2表达阳性的卵巢上皮性癌患者总生存期和无瘤生存期均低于SIAH2表达阴性的患者，并且SIAH2是卵巢癌总生存期和无瘤生存期的独立影响因素。本研究发现，SIAH2阳性表达患者5年生存率明显低于阴性表达者，5年中位生存时间也明显缩短，差异具有统计学意义；Cox多因素回归分析结果也表明，过表达SIAH2、临床分期和淋巴结转移是影响喉鳞状细胞癌患者预后的独立危险因素，提示SIAH2对喉鳞状细胞癌具有一定的预后评价作用。

综上所述，SIAH2在喉鳞状细胞癌组织中过表达，并且与喉鳞状细胞癌的进展和患者不良预后有关，推测SIAH2可能成为喉鳞状细胞癌诊断的生物学标志物和治疗的药物靶点，同时可以作为患者预后的预测因素，研究结果有待进一步证实。