地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉的抑制作用试验初报

赵严港

摘 要 测定了一株地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉菌的抑制率、菌丝的生长及游动孢子释放和萌发的影响。结果表明，地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉菌具有一定的抑制作用，抑制率达78.67%;可导致病原菌菌丝畸形、分支增多及原生质浓缩;对辣椒疫霉游动孢子释放和萌发的相对抑制率为36.91%和57.14%，与对照相比明显抑制了游动孢子的释放和萌发。

关键词 地衣芽孢杆菌;辣椒疫霉;抑制作用

中图分类号：S476 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.27.065

辣椒疫病是辣椒生产上的一种毁灭性病害，于1918年在美国新墨西哥州首次发现，我国江苏省于1940年报道此病的发生。辣椒疫病的流行发生，常导致植株成片死亡，损失严重，露地和保护地均发生，一般病株率为15%～30%，严重时达80%以上。同时，辣椒疫病在美国、加拿大、韩国等国家严重发生，均造成不同程度的损失[1-4]。辣椒疫病的发生给我国及世界各国的农业造成了巨大的经济损失，这使得有效防治此病的发生成为目前的主要任务。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和培养基

辣椒疫霉和地衣芽孢杆菌YC10，由微生物学实验室提供;辣椒疫霉菌培养用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）和V8培养基;地衣芽孢杆菌YC10发酵用牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA）和牛肉膏蛋白胨培养基（NB）。

1.2 地衣芽孢杆菌YC10发酵液的制备

采用摇瓶发酵培养法。地衣芽孢杆菌YC10在NA培养基上划线培养后，挑取单菌落于5 mL NB液体培养基中，28 ℃，120 r·min-1，过夜培养。取菌液按1∶50的比例接种到NB培养液中，振荡培养24 h。将地衣芽孢杆菌YC10发酵液在10 000 r·min-1，4 ℃条件下离心20 min，取上清液用细菌过滤器（滤膜孔径0.22 μm）除菌，即得无菌滤液，4 ℃保存备用。

1.3 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉的抑制作用

取1 mL地衣芽孢杆菌YC10无菌滤液与20 mL PDA培养基混匀，倒入培养皿，制备平板。将直径为5 mm的辣椒疫霉菌块接种于平板中央，28 ℃培养72 h，以不加无菌滤液的培养基培养的辣椒疫霉菌为对照。采用垂直十字法测量菌落直径，按公式（1）计算抑菌率。

1.4 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉菌丝形态的影响

按照吴辉等[5]的处理方法，在无菌条件下，用打孔器（直径8 mm）打取辣椒疫霉菌块，接种于50 mL PD培养基中，28 ℃，120 r·min-1振荡培养3 d。将形成的辣椒疫霉菌球置于无菌培养皿中，再将制备的地衣芽孢杆菌YC10发酵液按1∶5的比例倒培养皿中，分别以无菌水和NB液体培养基为空白对照，28 ℃培养箱中静置培养2 d。用接种针挑取悬浮在液体中的辣椒疫霉菌丝少许，用无菌水冲洗2～3遍后涂布玻片，置于倒置显微镜下观察。

1.5 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉游动孢子释放和萌发的影响

将在V8培养基上培养5 d的辣椒疫霉置于无菌水中，配制成浓度为105个/mL孢子囊悬浮液，将孢子囊悬浮液与地衣芽孢杆菌YC10发酵液按1∶1（体积比）的比例混合于无菌EP管中，以无菌水为空白对照。在4℃条件下黑暗处理6 h，促进游动孢子释放和萌发，于光学显微镜下观察游动孢子释放和萌发情况并计数。

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉的抑制作用

采用固体平板法，测量地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉菌丝生长抑制作用，结果发现YC10的发酵液对辣椒疫霉菌丝生长的抑制效果最明显，抑制率达到了78.67%。由图1可以看出，在含有YC10发酵液的培养基上辣椒疫霉生长缓慢，只生长出非常稀薄的基内菌丝，而对照培养基上辣椒疫霉正常生长。

2.2 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉对菌丝形态的影响

由图2可以看出，用无菌水处理的辣椒疫霉菌丝正常生长，菌丝形态饱满，细胞结构较为清晰，分枝少且径粗一致（图2a）。经地衣芽孢杆菌YC10发酵液液处理后，辣椒疫霉菌丝形态发生明显变化，菌丝畸形，分支增多，并伴随有明显的原生质浓缩等现象（图2b、c）。

2.3 地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉游动孢子释放和萌发的影响

由表1和表2可以看出，地衣芽孢杆菌YC10发酵液对辣椒疫霉游动孢子释放的相对抑制率为36.91%，对游动孢子萌发的相对抑制率为57.14%，与对照相比明显抑制了游动孢子的释放和萌发。

3 小结与讨论

地衣芽孢杆菌是一种土壤中常见的革兰氏阳性嗜热菌，可以产生抗菌活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制病原菌的生长繁殖。本研究从辣椒根际土壤中分离到了地衣芽孢杆菌YC10，研究发现其对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用。同时发现，地衣芽孢杆菌YC10的发酵液显著影响辣椒疫霉菌的菌丝形态，抑制了菌丝的生长和扩展，降低了游动孢子的释放和萌发率，阻止了病原菌的进一步侵染。本研究中地衣芽孢杆菌YC10产生的活性物质是如何抑制病原菌的生长、如何定殖寄主根部等防病机理还需要进一步研究，对于其在生产上的应用效果也有待于深入探索。

参考文献：

[1] Lee K， Kamala-Kannan S， Sub H， et al. Biological control of Phytophthora blight in red pepper （Capsicum annuum L.） using Bacillus subtilis[J]. World J Microbiol Biotechnol.2008，24：1139-1145.

[2] 汪涛，迟元凯，赵伟，等.多粘类芽孢杆菌TC35的鉴定及对辣椒疫病的田间防效[J].安徽农业科学，2018，46（4）：138-139.

[3] 邱思鑫，阮宏春，宋美仙，等.内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株活性物质诱导辣椒果抗疫病的生化机理[J].热带作物学报，2010，31（10）：1813-1820.

[4] 杨琦瑶，索雅丽，郭荣君，等.枯草芽孢杆菌B006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌组分分析[J].中国生物防治学报，2012，28（2）：235-242.

[5] 吳辉，潘梦武，高易红，等.辣椒疫病生防菌的筛选、鉴定及其抑菌机理初探[J].湖北农业科学，2015，54（7）：1596-1599.

（责任编辑：赵中正）