基于异黄酮类标志物的餐厨废弃油脂掺伪食用植物油鉴别

吴娆，窦心敬，张良晓，马飞，王秀嫔，丁小霞，张奇，李培武,5

(1.中国农业科学院油料作物研究所，湖北武汉 430062)(2.农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，湖北武汉 430062)(3.农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室，湖北武汉 430062)(4.农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心，湖北武汉 430062)(5.农业农村部生物毒素检测重点实验室，湖北武汉 430062)

我国是食用油生产和消费大国，食用油在居民膳食中占据着重要地位，食用油的质量安全问题一直以来都是政府和消费者高度关注的热点问题。在食用油加工、流通和使用过程中，餐饮业产生的餐厨废弃油脂（地沟油、潲水油）、煎炸老油等劣质油，氧化酸败程度较高，含有许多有害物质如黄曲霉毒素、重金属、表面活性剂、苯并芘、丙烯酰胺、热氧化聚合产物等[1,2]，若食用会严重损害消费者身体健康。这些劣质油作为废弃油脂，可以用于发展生物柴油、制造肥皂、表面活性剂等[3～6]加以回收利用，不能回收精炼重新投入食用油市场。然而在经济利益的驱使下，餐厨废弃油脂非法回收并经过一系列加工和精炼回流至餐桌的现象屡禁不止，并成为了不法商贩牟取高额利润的手段。为了保护消费者身体健康，维护消费者权益，探索和发展废弃油脂掺伪鉴别方法尤为重要。

目前废弃油脂鉴别方法的相关报道也很多，主要分为以下四类。一是基于常规理化指标如酸价、过氧化值、电导率等的方法[2]，然而废弃油脂在经过严格的精炼和深加工处理后，通常会在出厂前满足以上这些常规理化指标，因而该类方法已逐渐不能满足精炼废弃油脂的鉴别。二是基于红外、离子迁移谱、核磁共振等全谱宏观信号并结合化学计量学鉴别模型对废弃油脂进行识别[7～10]，该类方法建立模型时通常需要较大样本量，判别时基于概率，可能出现误判的情况。三是基于废弃油脂外源引入的特征成分进行鉴别分析，废弃油脂来源复杂，在回收利用过程中外源引入的潜在残留成分如胆固醇、辣椒素、十二烷基苯磺酸钠、黄曲霉毒素、重金属、氯离子、钠离子、乙酸根离子、香辛料挥发性成分茴香脑等[2,11～13]可以作为废弃油脂的鉴别指标。四是基于油脂在高温反复利用过程中内源性成分发生的变化，如反式脂肪酸、甘油三酯热氧化聚合产物等[14,15]指标。但是废弃油脂在经过高度精炼后，许多特征性成分可能会被除去，因而不具有代表性。

餐厨废弃油脂（地沟油）来源复杂，在回收利用时通常需要集中混合后再加以精炼处理，决定了其混合油脂的属性。大豆油因其价格优势，占据了大量市场份额，备受餐馆经营者的青睐，是餐饮行业中应用最普遍的食用油。廉价的大豆油可以降低经营成本，带来更高的利润，因此在混合的餐厨废弃油脂中几乎全部含有大豆油的痕迹。本研究旨在探究大豆油中标志物的热稳定性以及大豆异黄酮在食用植物油和餐厨废弃油脂中的分布，探究异黄酮类标志物在餐厨废弃油脂掺伪鉴别中的应用，为地沟油等废弃油脂检测和市场监管提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大豆，购买于中百超市（湖北武汉），利用全自动家用榨油机进行榨油。收集得到的大豆毛油，在4500 r/min下离心5 min，取上清油液备用。采集芝麻、油菜、茶籽、花生和亚麻籽，采用实验室自榨方式分别得到 100%纯芝麻油、菜籽油、茶籽油、花生油和亚麻籽油，所选食用植物油样品具有广泛的代表性。餐厨废弃油脂，收集来自不同地方的餐厨废弃油脂 15个，经过简单的吸附脱色处理。

掺伪油样：分别向茶籽油、菜籽油、花生油、芝麻油和亚麻籽油中掺入 5%（质量分数）餐厨废弃油脂，制备掺伪油样。

制备的油样均置于4 ℃条件下避光储藏，以供实验分析用。

1.2 主要仪器设备

全自动家用榨油机，液相色谱串联三重四极杆质谱(TSQ Quantum Ultra)，美国Thermo公司；Milli-Q超纯水系统；KQ-600B超声仪；BF-2000型氮气吹干仪；DB-3电热板；旋转蒸发仪；电子天平等

1.3 试剂

甲醇、正己烷、甲酸均为色谱纯；醋酸、FeCl3·6H2O、石油醚、乙二醇、无水乙醇、乙酸钠均为分析纯；羧基化多壁碳纳米管购买于南京先丰纳米材料科技有限公司(长度约30 μm，直径＜8 nm，羧基含量：3.86%)；异黄酮类标准品黄豆苷（Daidzin，纯度≥98%）、染料木苷（Genistin，纯度≥97%）、黄豆苷元（Daidzein，纯度≥95%）、染料木素（Genistein，纯度≥97%）均购买于sigma。

1.4 实验方法

1.4.1 标准品溶液的配制

准确称取标准品黄豆苷、黄豆苷元、染料木素和染料木苷各 10.0 mg，分别用甲醇进行溶解，定容至10.0 mL，即得1.0 mg/mL单一标准品储备液，转移至专用棕色瓶内，-20 ℃避光保存；分别移取0.1 mL单一标准品储备液混合，用甲醇定容至10.0 mL，制备10.0 μg/mL混合标准贮液转移至棕色瓶中，封口膜封好保存于4 ℃冰箱，使用时用甲醇稀释成不同浓度梯度的系列标准工作液，现配现用。

1.4.2 磁性羧基化多壁碳纳米管复合材料（c-MWCNT-MNPs）的制备

参考已报道的方法[16]并稍做调整合成复合材料c-MWCNT-MNPs。称取0.2 mg的羧基化多壁碳纳米管粉末于50 mL内含磁搅拌子烧杯中，加入1.8 g乙酸钠和0.7 g FeCl3·H2O，再量取40 mL乙二醇倒入其中，进行磁力搅拌，搅拌30 min，将溶液装入100 mL聚四氟乙烯内胆高温反应釜中，200 ℃下反应12 h。待充分反应结束后，冷却至室温，将内胆中的上清液弃丢，其残留黑色沉淀物用水来回超声清洗5次，之后再用无水乙醇来回超声洗涤5次，用玻璃瓶收集沉淀物，在 60 ℃水浴下利用旋转蒸发仪进行干燥，去溶剂，得到黑色粉末物质即复合材料磁性羧基化多壁碳纳米管，实验备用。

1.4.3 样品提取

准确称取0.5 g待测油样于10 mL玻璃试管内，加入4.0 mL正己烷稀释，混匀，再加入5 mg磁性羧基化多壁碳纳米管复合材料，涡旋提取 2 min，磁吸倒液；加入1 mL石油醚进行杂质淋洗，磁吸倒液；用3 mL 0.02%（V/V）甲酸无水乙醇溶液洗脱，超声6 min，磁吸，上清液过0.22 μm有机膜，收集液体，氮吹浓缩，用200 μL 1：1流动相溶液复溶，供LC-MS/MS分析。

1.4.4 液相色谱质谱分析

液相色谱条件：色谱柱为Hypersil Gold C18反相色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm），流动相A 0.01%（V/V）醋酸-甲醇溶液，流动相B 0.01%（V/V）醋酸-水溶液，流速是 200 μL/min，进样量 10 μL，柱温30 ℃，梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Elution program for liquid chromatography

质谱条件：离子源选用ESI源，选择正离子模式扫描，喷雾电压为4000 V，毛细管温度为270 ℃，检测方式为SRM（选择离子扫描）模式，鞘气为30 psi（氮气），辅助气为5 arb（氮气），碰撞气为1.5 mTorr（氩气），扫描时间为0.2 s，化合物离子对信息如表2所示。

表2 异黄酮类化合物的质谱参数条件Table 2 LC-MS/MS parameters for isoflavonoid compounds

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立及评估

本实验采用外标法进行定量，每一种化合物选择其最强特征离子（m/z）的峰面积与对应浓度拟合回归方程。定量数据处理软件利用 Xcalibur软件(Version 2.0.7；Thermo Fisher Scientific，USA)，以每种化合物的系列标准品浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标，绘制对应物质的标准曲线，得到曲线方程，通过标准方程计算得出提取液浓度，最后根据单位换算从而得到植物油中含量。根据信噪比（S/N）3倍和10倍分别确定各个化合物的检出限（Limit of detection，LOD）和定量限（Limit of quantitation，LOQ），线性方程及相关系数、灵敏度等参数如表3所示。

表2 异黄酮类化合物标准曲线、相关系数及灵敏度Table 3 Standard curve, equations coefficients (R2) and sensitivity of isoflavonoid compounds

2.2 大豆油中异黄酮类物质的热稳定性研究

图1 加热时间对大豆异黄酮含量的影响Fig.1 Effects of heating time on isoflavone contents

前期制备的大豆油样，分装部分于100 mL烧杯中，放在电热板上于160 ℃加热，模拟反复加热过程，分别经过0、2、6、10和14 h加热，在不同时间点各取出其中一部分油样进行编号，后续实验备用。

分别从不同时间段中准确称取0.5 g大豆油样于10 mL试管中进行异黄酮类物质的提取分析，其操作步骤见样品提取部分，待测样品经LC-MS/MS分析，探究大豆油中异黄酮类物质的热稳定性。异黄酮物质的含量变化如图1所示。

从图1可以看出，在前2 h内，加热对异黄酮含量影响最大，四种化合物含量明显下降，而在之后的加热过程中，尤其是8～14 h之间，异黄酮类物质含量趋向平稳，表明异黄酮类物质对热相对稳定，在反复精炼过程中可能不易除尽；结果表明，黄豆苷和染料木苷在加热的过程中明显的降低，可能与糖苷键断裂有关。虽然黄豆苷元和染料木素的含量相对有所降低，但其含量比之前测定的其他自榨食用植物油中黄豆苷元和染料木素含量高出很多，其他食用植物油不含有黄豆苷元和染料木素或者不同时含有。因此，黄豆苷元和染料木素可以作为餐厨废弃油脂掺伪鉴别新的标志物，为鉴别餐厨废弃油脂掺伪提供可靠的依据。

2.3 餐厨废弃油脂中异黄酮类物质定量分析

表4 餐厨废弃油脂中大豆异黄酮类含量Table 4 Contents of isoflavonoids in waste oils（μg/kg）

利用c-MWNT-MNPs-LC-MS/MS方法对15个餐厨废弃油脂中大豆异黄酮类物质进行定量分析，每个样品测定三次，结果取平均值，并计算标准偏差，得到餐厨废弃油脂中大豆异黄酮类含量分布情况，见表4。

从表4中结果可知，餐厨废弃油脂中黄豆苷元平均含量在 5.4～221.5 μg/kg之间，染料木素介于10.2～230.5 μg/kg之间，黄豆苷和染料木苷含量非常低，有些甚至检测不到，这可能是由于在加热过程中，黄豆苷和染料木苷中糖苷键遭到破坏，与大豆油中异黄酮类物质热稳定性研究结果一致。进一步比较大豆油和废弃油脂中异黄酮类种类和含量，大豆油中同时含有四种大豆异黄酮，而废弃油脂中的黄豆苷元和染料木素含量高，以及染料木苷少量，且都不含有黄豆苷。利用种类和含量关系的差异，通过检测黄豆苷和染料木苷即可将大豆油和废弃油脂加以区分。其他食用植物油不含有或者不同时含有大豆异黄酮类化合物，因此黄豆苷元和染料木素可以作为识别餐厨废弃油脂与其他食用植物油新的标志物，为建立鉴别餐厨废弃油脂掺伪技术提供参考依据。

2.4 聚类分析

为了更直观的反映餐厨废弃油脂与食用植物油聚类效果以及异黄酮类化合物的分布，本文对废弃油脂异黄酮类含量与其他食用植物油含量数据在代谢组学网络分析平台MetaboAnalyst 3.0中进行HCA分析，得到图2所示的热图。

图2 餐厨废弃油脂与其他食用食用植物油的系统聚类分析热图Fig.2 Heatmap for restaurant waste oil and edible plant oils

在图2中，可以清晰明了的看到异黄酮类物质在餐厨废弃油脂以及其他食用植物油中的分布。大豆油中含有丰富的异黄酮类成分，并且黄豆苷元颜色最深，代表含量最高，其次是染料木素，然后是黄豆苷和染料木苷；而废弃油脂中黄豆苷元和染料木素含量高，因此以黄豆苷和染料木苷标志物即可将大豆油和餐厨废弃油脂区别开来。在图2中1号红色与2号绿色没有重叠部分，表示完全分开；对比其他食用植物油与餐厨废弃油脂，其他食用植物油中几乎不含有或者含有微量的黄豆苷元或染料木素，指纹图谱相近；而餐厨废弃油脂相反，在图中其他颜色所代表的食用植物油与1号红色没有交叉，这表明餐厨废弃油脂能够完全与其他食用植物油分开，所以可以将黄豆苷元和染料木素作为餐厨废弃油脂新的标志物，用于识别食用植物油中餐厨废弃油脂掺伪现象。

2.5 标志物在实际掺伪样品鉴别中的应用

从异黄酮类化合物在废弃油脂中分布及聚类分析得出的结论，以黄豆苷元和染料木素为废弃油脂标记物，建立餐厨废弃油脂掺伪鉴别方法。选取茶籽油、花生油、葵花籽油、亚麻籽油和芝麻油作为掺伪对象，将餐厨废弃油脂分别掺入正常食用食物油中，其掺伪量为5%，油样经过前处理，供LC-MS/MS分析，每个样品测定三次，定量分析结果见表5。

由表5可知，在菜籽油、花生油、茶籽油、亚麻籽油及芝麻油当中掺入 5%餐厨废弃油脂，都能检出餐厨废弃油脂的标志物，即黄豆苷元和染料木素，确证性地鉴别餐厨废弃油脂的掺伪行为，为打击废弃油脂掺伪现象提供一种检测手段。

在色谱图上可以更加直观地呈现出来，如图3所示，是当芝麻油中掺入 5%餐厨废弃油脂时异黄酮类化合物的谱图。图3（a）是纯芝麻油样中异黄酮类化合物的色谱图，（b）是掺入 5%餐厨废弃油脂的芝麻油中异黄酮类化合物色谱图。从图3中可以看出，在纯芝麻油样中没有检测到异黄酮；当掺伪 5%餐厨废弃油脂后，就能明显的看到黄豆苷元和染料木素的峰，而黄豆苷和染料木苷未检测到，这就直观上说明不是纯芝麻油，并且能肯定是掺伪了餐厨废弃油脂而非大豆油。由此看出，以异黄酮类物质作为餐厨废弃油脂的标志物，可以有效鉴别餐厨废弃油脂掺伪，是一种灵敏度高、确证性检测技术。

表5 掺伪5%餐厨废弃油脂的各食用植物油中大豆异黄酮类含量Table 5 Contents of isoflavonoids in vegetable oils adulterated with 5% waste oil

图3 芝麻油(a)和掺伪餐厨废弃油脂的芝麻油(b)色谱图Fig.3 Chromatograms of sesame oil and sesame oil blended with waste oil

3 结论

本文通过对废弃油脂来源及流通进行分析，以大豆油异黄酮类标志物为切入点，探究了异黄酮类标志物的热稳定性以及大豆异黄酮在食用植物油和餐厨废弃油脂中的分布。筛选到餐厨废弃油脂新的标志物：黄豆苷元、染料木素；在反复加热模拟实验中，标志物经过14 h持续加热仍然存在，且含量比其他食用植物油高得多，结果表明标记物具有热稳定性，加工过程中不易除尽；同时，测定了标志物在餐厨废弃油脂及植物油中的分布，聚类分析表明异黄酮类物质不仅能够实现其他食用植物油中大豆油或餐厨废弃油脂的掺伪鉴别，亦可区分大豆油和餐厨废弃油脂。异黄酮类物质是废弃油脂中一种有效可靠的标志物，本文探究考察了以异黄酮类物质为标志物的餐厨废弃油脂掺伪鉴别方法，该方法结果准确可靠，为地沟油等废弃油脂检测和市场监管提供参考依据。