羊抗人ApoB高效价抗血清制备方法的建立与优化

徐志伟， 徐小波， 于建宁， 刘伟忠

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容212400；2.江苏省农业科学院畜牧研究所/农业部种养结合重点实验室，江苏南京 210014)

载脂蛋白(apolipoprotein，简称Apo)是指血浆脂蛋白中的蛋白质部分，Apo既是脂蛋白的构成部分，又具有稳定脂蛋白的功能，同时能修饰并影响与脂代谢有关的酶活性[1]。ApoB与胆固醇组成低密度脂蛋白(low density lipoprotein，简称LDL)，能识别LDL受体，介导LDL代谢[2-3]，所以ApoB在维持体内血脂恒定、脂类代谢与转运中发挥重要作用。因此，人ApoB的检测在糖尿病、冠状动脉综合征等心血管疾病的诊断和临床治疗方面具有重要意义[4-5]。可通过测定ApoB反映低密度脂蛋白指标，而且ApoB/ApoA1的值是动脉粥样硬化等疾病预测和诊断的重要参考。测定载脂蛋白及脂蛋白对分析心血管类疾病的状态很有价值[4]。然而用于检测ApoB的试剂盒尚不成熟，其难点是制备高效价和高特异性的免疫血清，目前通过大动物免疫获得血清中的抗体效价一般都不高，提高抗体效价的研究是很有价值的。

本试验研究用人ApoB抗原免疫湖羊，通过不同免疫剂量、不同免疫途径及不同羊年龄的比较，形成并优化羊抗人ApoB高效价抗血清的制备方法，以期为规模化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验羊与试验期 试验在江苏省句容市行香羊场实施，试验期(含预试7 d)为2017年5月8日至2017年6月20日。选择该羊场健康湖羊公羊，幼年羊10头(6～10月龄，平均7.4月龄，平均体质量42.4 kg)；成年羊70头(15～22月龄，平均18.6月龄，平均体质量50.9 kg)；老年羊10头(28～42月龄，平均35.1月龄，平均体质量62.9 kg)。为利于羊身体健康和获得好的试验效果，采用放牧和舍饲相结合的饲养方法，白天放牧4 h，上午、下午各2 h，晚上饲喂精料1次，15 d 后开始试验。

1.1.2 抗原与佐剂 ApoB抗原购自元升生物科技(上海)有限公司，纯度为96%；完全弗氏与不完全弗氏佐剂购自Sigma公司。

1.2 试验设计

1.2.1 不同免疫剂量比较 将30头成年羊按月龄和体质量平均分为3组；免疫途径为皮下多点注射，注射点分别为腹股沟3个点、肘部2个点、颌下1个点、背侧2个点、耳后1个点，2侧共计18个点；抗原量分别为第1组0.2 mg/(次·头)，第2组0.4 mg/(次·头)，第3组1.0 mg/(次·头)，无论抗原量多少，均统一用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，简称PBS)+完全弗氏与不完全弗氏佐剂乳化成2 mL量；免疫程序：共计5次免疫，第1次、第2次间隔15 d，第2次至第5次均间隔7 d。

1.2.2 不同免疫途径比较 试验羊分组与不同免疫剂量比较试验相同，免疫剂量均为0.4 mg/(次·头)；免疫程序同“1.2.1”节；免疫途径：第1组为肌肉多点注射，后腿肌肉群3个点、前腿肌肉群2个点、颌下1个点、背侧2个点、耳后1个点，2侧共18个点；第2组为皮下多点注射同“1.2.1”节；第3组为皮内+淋巴多点注射，第1次免疫18个点位置同“1.2.1”节(皮下改成皮内)；第2次免疫18点的同时，另加2侧腹股沟淋巴结，共20个点；第3～7次免疫仍然免疫18个点。

1.2.3 不同羊年龄比较 试验羊分为3组，分别为幼年羊组、成年羊组、老年羊组，每组10头羊；免疫剂量为 0.4 mg/(次·头)；免疫途径和免疫程序同“1.2.1”节。

1.3 免疫羊观察与抗体监测

每天观察羊的动态，采食情况，精神状况，作好记录。每组试验羊随机抽取5头羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5 d分别采血并采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)法进行抗体检测，作好记录。

1.4 血清制备与抗体效价测定

待血液凝固之后，在超净工作台中用无菌滴管把血块剥离瓶壁，在37 ℃条件下放置1～2 h，放入4 ℃冰箱过夜，血清充分析出后经离心沉淀分离出血清，放进-20 ℃低温冰箱保存。

抗血清效价测定采用常规的琼脂扩散方法。设定标准阳性血清孔和阴性孔，标准阳性血清孔和抗原孔之间出现明显的致密白色沉淀线，而阴性孔则不出现。

2 结果与分析

2.1 不同免疫剂量对免疫效果的影响

对0.2、0.4、1.0 mg/(次·头)3个免疫组，分别于免疫前、二免前、三免前、五免后检测血清中抗体效价，从表1可以看出，二免疫前，0.2 mg/(次·头)组抗体效价为1 ∶25～1 ∶26，随后逐渐升高到1 ∶28；0.4 mg/(次·头)组明显高于其他2组，五免后达到1 ∶28～1 ∶29；而1.0 mg/(次·头)组二免疫前略高于0.2 mg/(次·头)组，但三免前、五免后明显低于0.2 mg/(次·头)组。

表1 不同免疫剂量抗体效价比较

2.2 不同免疫途径对免疫效果的影响

肌肉多点、皮下多点、皮内+淋巴3种免疫途径的抗体产生规律见表2，肌肉多点免疫法抗体产生效率最低，二免前大多为1 ∶25，三免前大多为1 ∶26，五免疫后平均达不到 1 ∶27；皮下多点及皮内+淋巴的方法免疫效果接近，从二免前开始抗体效价就明显高于肌肉多点组，至五免后80%的羊抗体效价达到了1 ∶29，且皮下多点与皮内+淋巴2组间没有差异。

2.3 免疫羊年龄对免疫效果的影响

从表3可以看出，6～10月龄的幼年羊与 28～42月龄的老年羊免疫产生抗体的水平接近，二免前、三免前和五免后抗体水平分别为1 ∶25、1 ∶26和1 ∶27左右，且组内差异较大，远不如15～22月龄的成年羊，二免前、三免前和五免后15～22月龄成年羊的抗体水平分别接近1 ∶26、1 ∶27和1 ∶29。

3 结论与讨论

3.1 不同免疫剂量对免疫效果的影响

3个免疫剂量以0.4 mg/(次·头)免疫效果最好，免疫剂量过低[0.2 mg/(次·头)]与过高[1.0 mg/(次·头)]都不利于抗体的产生。通常情况下，免疫剂量太小时因刺激小不易产生免疫应答，产生抗体少，随着剂量加大，抗体水平会不断提高， 但剂量大到一定程度抗体就不再继续增加。本试验高剂量组出现了抗体水平反而降低的情况，是否是因为高剂量引起了“免疫耐受”或是“免疫抑制”还有待继续研究。

表2 不同免疫途径抗体效价比较

表3 不同年龄免疫羊抗体效价比较

3.2 不同免疫途径对免疫效果的影响

3种免疫途径中肌肉注射反应较差，皮下多点及皮内+淋巴2种途径效果一致，但皮下注射操作相对比较方便。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(CYS-C)免疫试验中发现，皮内+淋巴的免疫方法效果明显好于皮下多点(笔者所在团队做的同期试验，尚未发表)，但本试验未能有同样效果，这可能是由于CYS-C分子量小，皮内+淋巴注射能增加刺激强度，而ApoB分子量较大，皮下注射已达到足够的刺激强度。

3.3 免疫羊年龄对免疫效果的影响

15～22月龄的成年羊对ApoB抗原的反应强度明显高于6～10月龄的幼年羊与28～42月龄的老年羊。出现这一结果的原因可能是幼年羊的免疫功能尚不健全，而老年羊的免疫功能开始退化；另外，幼年羊与老年羊组内差异较成年羊大，一方面说明幼年羊6～10月间免疫功能发育比较快，另一方面说明老年羊组内年龄差距太大，28月龄羊功能接近成年羊，而42月龄羊功能已大幅衰退。

综上所述，本试验通过不同免疫剂量、不同免疫途径及不同羊年龄的比较，初步形成了一套以湖羊为对象的羊抗人ApoB高效价抗血清的免疫制备方法，效价接近1 ∶29。但影响免疫效果的因素很多，除了抗原自身性质及本研究的因素之外，抗原的注射剂量、注射次数、间隔时间及抗原佐剂等都会对抗体效价产生影响[6-9]，要真正形成最优方法还须要对其他因素及各因素间的互作进行研究与分析。