3种酚类物质对油茶炭疽病病菌的抑菌机制

杨 婷， 李仟仟， 史红安， 吴梅风， 张志林， 王立华

(1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室/湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000；2.湖北大学生命科学学院，湖北武汉 430062)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellial)植物，为我国特有的优质食用油料植物[1]。茶油易被人体吸收，且烟点高，不含对人体有害的黄曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分[2-3]。此外，茶油还具有保健功能，能提高人体免疫能力，减轻脂肪堆积，降低血浆中胆固醇浓度，有效改善和预防高血压、冠心病、动脉硬化等心血管疾病[4-6]，是一种高档的保健食用油。茶油被联合国粮食及农业组织作为重点推广对象[7]。但是随油茶种植面积的增加，油茶病害日趋严重，生产绿色无公害茶油，已成为我国油茶产业可持续发展急需解决的关键问题[8]。

油茶炭疽病病菌(Colletotrichumgloeosprioides)是油茶的主要病害之一，严重影响油茶的生长和产量[9]。萜类化合物为植物代谢的主要产物，具有抑菌活性强、低毒、易降解、不污染环境、不易产生抗性等优点，是一种安全高效的天然杀菌剂[10-11]。前期研究发现，萜类化合物中香芹酚、丁香酚、异丁香酚对油茶炭疽病病菌具有较好的抑制活性。本试验研究香芹酚、丁香酚、异丁香酚对油茶炭疽病病菌细胞膜通透性、可溶性蛋白和还原糖含量的影响，了解其作用机制，以期为将香芹酚、丁香酚、异丁香酚开发成天然杀菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试萜类化合物

香芹酚(carvacrol)、丁香酚(eugenol)、异丁香酚(isoeugenol)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，纯度大于95%。

1.2 供试病原菌

油茶炭疽病病菌从湖北省孝感市区植物病株上采得，采用常规组织分离法分离纯化病原菌，并观察其形态学特征，同时结合rDNA-ITS(内转录间隔区)序列分析，对病原菌进行分离和分子鉴定得到[12]。

1.3 试验方法

1.3.1 萜类化合物对病原菌菌丝形态的影响 在无菌条件下，用6 mm打孔器在培养好的供试菌菌落边缘打取长势相同的菌饼接入萜类化合物系列浓度梯度为50、100、200、400 μg/mL 的PDA培养基平板中，每个处理设3次重复，以不加药的PDA平板作为对照，培养6 d后，挑取菌落边缘的菌丝，在显微镜下观察菌丝的形态变化。

1.3.2 细胞膜通透性试验 (1)菌丝体培养。将油茶炭疽菌在PDA培养基上培养7 d，取直径为6 mm的菌饼数，放入含有200 mL PD培养基的三角瓶中，培养7 d(28 ℃，180 r/min)。在无菌条件下将菌丝团取出，用灭菌的去离子水冲洗3次后，再用布氏漏斗抽滤，收集菌丝体。

(2)电导率测定。称取1 g菌丝，放入含有100 mL灭菌去离子水的三角瓶中，分别加入香芹酚、丁香酚、异丁香酚至系列浓度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以无菌去离子水加溶剂作为对照，每个处理重复3次，于摇床上振荡培养(28 ℃，180 r/min)，室温下，于0、30、60、90、120 min时测定电导率。根据下式计算各处理随时间的延长引起的电导率增加的幅度：

电导率增幅=(不同时间电导率-0 min时的电导率)/0 min时的电导率×100%。

1.3.3 可溶性蛋白含量测定 (1)菌丝体培养。具体方法同“1.3.1”节。

(2)酶液制备。称取5 g菌丝，放于含有100 mL PD培养基的三角瓶中悬浮，分别加入香芹酚、丁香酚、异丁香酚至系列浓度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以无菌去离子水加溶剂作为对照，每个处理重复3次。处理12 h后，在无菌条件下将菌丝取出，用磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH值为7.5)冲洗2次，之后用布氏漏斗抽滤。称取0.5 g菌丝，移入加有2 mL磷酸缓冲液的研钵中，冰浴下研磨至糊状，加入磷酸缓冲液至体积为10 mL，于4 ℃离心(12 000 r/min)15 min，收集上清液备用。

(3)可溶性蛋白含量的测定。采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量，吸取1 mL酶液至10 mL离心管中，再加入 5 mL 考马斯亮蓝，摇匀，静止5 min，以1 mL蒸馏水+5 mL考马斯亮蓝作为空白对照，于595 nm测定吸光度，每个处理重复3次。通过标准曲线查得蛋白质含量，根据以下公式计算样品中蛋白质含量(mg/g)：

样品中蛋白质含量=C×Vt/(Vs×WF×1 000)。

式中：C为查标准曲线所得含量μg/g；Vt为提取液总体积，mL；Vs为测定时加样量，mL；WF为样品鲜质量，g。

1.3.4 还原糖含量的测定 菌丝体培养同“1.3.1”节，酶液制备同“1.3.3”节。还原糖含量的测定：用二硝基水杨酸(DNS)法测还原糖含量，取制备的酶液1 mL，空白对照用去离子水代替，加入2 mL DNS，于沸水中加热5 min，取出后立即浸入冷水中冷却至室温，再加去离子水定容至10 mL，在540 nm处比色并记录D540 nm，重复3次，取平均值。还原性糖含量(mg/g)计算公式如下：

样品中还原糖含量=(a×Vt/V)/m。

式中：A为根据标准曲线计算得到的还原糖含量，mg/g；Vt为提取液总体积，mL；V为测定液体积，mL；m为样品质量，g。

1.4 数据处理

试验数据采用Execl 2010和SPSS 19.0统计分析软件处理。用SPSS软件进行单因素方差分析，处理间差异多重比较采用Duncan氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 酚类物质对病原菌菌丝形态的影响

由酚类对供试病原菌菌丝生长抑制效果(图1)可以看出，香芹酚、丁香酚、异丁香酚对供试菌具有明显的抑制作用，且菌落直径随着酚类物质浓度的增加而变小。同时，经醛类化合物处理后的菌丝粗细不均、畸形、发生扭曲、分支增多(图2)。

2.2 对油茶炭疽菌细胞膜通透性的影响

酚类物质对油茶炭疽菌菌丝电导率变化的测定结果表明，油茶炭疽菌菌丝处理液的电导率均随着处理时间的延长而升高，且电导率增幅均随着酚类物质浓度的增大而増大(图3～图5)。

香芹酚处理30 min时，50、100 μg/mL浓度的电导率增幅变化不大；当处理时间大于30 min时，浓度为 100 μg/mL 的电导率增幅明显高于浓度为50 μg/mL的。丁香酚处理 30～60 min时，50、100、200 μg/mL浓度处理下的电导率增幅较小，60 min后电导率增幅随着浓度的增加而上升。异丁香酚处理浓度为50 μg/mL时，电导液的电导率与对照无明显差异，在100、200、400 μg/mL浓度下，电导液的电导率增幅明显高于对照。

2.3 油茶炭疽菌菌丝的可溶性蛋白含量

处理12 h后，油茶炭疽菌菌丝体内可溶性蛋白含量测定结果表明，油茶炭疽菌菌丝体内可溶性蛋白含量均随着浓度的降低而下降(表1)。当香芹酚、丁香酚、异丁香酚浓度为400 μg/mL时，可溶性蛋白含量最低，分别为7.55、7.69、8.01 mg/g，与对照相比分别下降了46.49%、45.50%、43.23%。

2.4 还原糖含量的测定结果

由表2可以看出，经香芹酚、丁香酚、异丁香酚处理后，胶孢炭疽菌菌丝体内还原糖含量都随着浓度的升高而下降，当酚类物质浓度为400 μg/mL时，还原糖含量最低，分别为 4.95、6.18、5.71 mg/g，较对照分别下降59.82%、49.84%、53.65%。

3 讨论与结论

菌体细胞膜为菌体的保护屏障，能调节和选择物质进出。

表1 3种酚类物质对油茶炭疽菌菌丝可溶性蛋白含量的影响

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

膜通透性增大是细胞膜受到损伤的主要表现之一。细胞膜受到损害后，其通透性增大，不能有选择地运送细胞内外的营养物质和代谢产物，导致细胞内含物外泄，使菌丝体失去正常生长所需的营养物质，扰乱代谢途径，从而迫使菌体死亡[13]。

表2 3种酚类物质对油茶炭疽菌菌丝还原糖含量的影响

Odds等研究表明，作用于细胞膜的抑菌物质可使细胞膜通透性增大，使其内含物如蛋白质、核酸、还原糖、金属离子Na+、K+等外泄[14-15]。在本试验中，经酚类物质处理后，炭疽菌菌体液电导率随着处理时间的延长而呈逐渐上升的趋势，并且随着酚类物质浓度的增加，电导率增幅增加。汪金莲等研究茶多酚对稻瘟病菌的抑制得出，茶多酚使稻瘟病菌的细胞膜通透性增大，从而破坏细胞膜的结构，使其失去保护屏障，由此达到抑菌目的[16]。由此推测，酚类对炭疽菌抑菌活性是其损伤或破坏菌体细胞膜的结构，导致大量内含物外泄，最终导致菌体死亡，但是其具体作用位点还须进一步研究。

彭璇等研究白薇提取液对意大利青霉的抑菌机制时发现，其提取液可以降低意大利青霉菌菌丝体内总糖、可溶性蛋白含量[17]。蛋白质是构成细胞膜的主要成分之一，是菌丝维持生命活动所需的基本物质[18]。菌体内蛋白质含量减少，会使菌丝体生长受到影响。经香芹酚、丁香酚、异丁香酚处理后，油茶炭疽菌菌丝体内可溶性蛋白含量都随着处理液浓度的升高而下降。周梦娇等研究发现，桂枝提取物对指状青霉具有抑制作用，通过测定其电导率变化、可溶性蛋白质和总糖含量，研究其抑菌机制，结果表明，指状青霉金桂枝提取物经处理后，菌丝体内可溶性蛋白、可溶性糖含量均减少[19]。

还原糖是菌体细胞的主要能源物质之一，是维持病原菌细胞正常生理代谢所需的能量来源和物质基础，还原糖的利用率直接影响菌丝生长和繁殖[20-22]。在本研究中，2种病原菌经处理后，体内还原糖含量减少，且含量随着酚类物质浓度的升高而降低，表明萜类物质促进菌体细胞内还原糖的分解，使菌体失去能量物质，扰乱菌体的生理代谢，从而导致菌体死亡。

综上述分析，萜类化合物香芹酚、丁香酚、异丁香酚增大了供试菌的细胞膜透性，使菌体内含物外泄或抑制菌体内能量物质的合成代谢，从而到达抑菌目的。