洋葱EST-SSR标记在大葱中的通用性及多态性分析

王其鹏， 王丽乔， 张巍巍， 袁瑞江， 冯大领

(1.河北农业大学现代科技学院，河北保定 071000； 2.石家庄市农林科学研究院蔬菜研究所，河北石家庄 050021；3.河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000)

葱(AlliumfistulosumL.)是百合科(Liliaceae)葱属(AlliumL.)多年生草本植物。在我国有3个变种，即普通大葱(A.fistulosumL. var.giganteumMakion)、分葱(A.fistulosumL. var.caespitosumMakino)和楼葱(A.fistulosumL. var.viviparumMakino)，各个变种内还有不同的栽培类型。在北方地区种植的章丘大葱、北京高脚白、河北隆尧大葱、山东莱芜鸡腿葱等均为普通大葱的栽培类型[1]。大葱在我国栽培历史悠久，不仅作为重要的蔬菜和调味料作物，其食用及药用价值也不断被人们发掘[2-3]，因此大葱的价值越来越被人们所重视。但长期以来，大葱育种工作发展缓慢，大葱作物的品质和产量潜力尚未被充分挖掘。

EST-SSR是目前分子育种中最常用的分子标记之一。EST-SSR标记来源于表达基因中相对保守的序列，该标记不仅能够直接反映基因的编码信息，也为功能基因的直接鉴定提供依据，还可以在种内不同栽培类型、属内不同种甚至科内不同属种之间具有较好的通用性[4-7]。日本和美国学者开发了葱属植物的EST-SSR标记[8-10]，进而日本学者Hikaru等利用42个洋葱SSR、InDel、CAPS、dCAPS标记和212个大葱SSR标记构建了大葱基于SSR标记的染色体连锁图谱[11]。我国大葱种质资源丰富，栽培类型多种多样，分析洋葱EST-SSR标记在不同大葱种质资源上的通用性研究还少有报道。本研究选用洋葱EST-SSR标记对大葱的多份种质资源进行分析，为大葱种质资源鉴定、杂种纯度分析、亲缘关系分析等研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及基因组DNA的提取

本试验材料为31个不同来源的大葱自交系(表1)，于2015年春季在石家庄农林科学研究院蔬菜研究所大葱试验基地取材，在河北农业大学蔬菜种质创新与利用实验室内完成。

选取新鲜幼嫩的大葱叶片，采用常规CTAB法提取基因组DNA，-20 ℃保存。

1.2 EST-SSR标记来源

EST-SSR标记引自VegMarks网站(https：//vegmarks.nivot.affrc.go.Jp/VegMarks/jsp/index.jsp)，选取洋葱不同连锁群上的EST-SSR标记，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表1 大葱自交系材料

表2 洋葱不同连锁群的EST-SSR标记

1.3 PCR反应体系及反应条件

PCR反应体系(10 μL)：DNA模板1 μL，10×DNA Buffer(含Mg2+)1 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.8 μL，100 μmol/L 引物各0.5 μL，5 U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL，ddH2O 6.1 μL。

PCR反应程序：标记1、2、5、6、8、9、10、11、12、14的反应程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 4 min，终止反应。标记3、4、7的反应程序为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 4 min，终止反应。标记13的反应程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10个循环；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 4 min，终止反应。

试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 PCR产物检测

PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳，GoldView显色，并在Bio-Rad Universal Hood Ⅱ紫外凝胶成像系统下拍照。

1.5 数据处理

统计14对引物对31个自交系的扩增结果时，在相同的迁移位置上有带的计为“1”，无带的计为“0”，缺失的记为“9”。用数值分类与多变量分析系统(numerical taxonomy and multivariate analysis system，NTSYSpc)软件进行处理，非加权配对算术平均(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)法进行聚类分析，获得聚类图和遗传距离。

2 结果与分析

2.1 洋葱EST-SSR标记在不同大葱自交系中的通用性分析

由表3可知，采用14对来自于洋葱的EST-SSR引物对31个大葱自交系进行扩增，除了4号引物外，其余13对引物均在31个自交系中有扩增产物，占检测引物的92.86%。说明洋葱的13对EST-SSR引物在大葱不同自交系的基因组上有良好的通用性。4号引物ACM024未能在大葱31个不同自交系上扩增到PCR产物，可能是因为该引物为洋葱特有。ACM024位于洋葱2号染色体，可用于在分子水平上鉴定大葱和洋葱。

2.2 洋葱EST-SSR标记在大葱不同自交系中的多态性表现

由表3可知，在13对有扩增产物的引物中，有多态性的引物有10对，分别为ACE101、ACE127、ACE113、ACE111、ACE087、ACE088、ACM154、ACE020、ACE044、ACE039，占总引物的71.43%，占有扩增产物引物的76.92%。多态性表现最好的引物是ACE088，该引物在其中1个自交系中未扩增出条带，在13个自交系中扩增出2条条带，在7个自交系中扩增出3条条带，在9个自交系中扩增出4条条带，而其他引物只在少数自交系中表现出多态性。在13对引物中没有表现出多态性的是ACM005、ACM071、ACM096。

表3 洋葱14对EST-SSR引物在31个大葱自交系的扩增结果

13对引物在31个自交系中共检测到等位位点28个，平均每对引物可以检测到2.15个。其中ACM154、ACE020、ACE101、ACE044、ACE039、ACE113可以检测到2个；ACE111、ACE087、ACE127可以检测到3个；ACE088可以检测到4个。

2.3 大葱31个自交系的聚类分析

由图1可以看出，在相似性系数0.66水平上，该类群自交系可分为2类，一个是自选材料1，一个是其他类型。在相似性系数0.81水平上，可分为6类，一是自选材料1，二是24，三是5、6、8，四是19、27、23、26、25、29、31、30，五是11、28、15，六是2、3、13、18、20、21、4、16、7、12、17、9、10、14、22。在相似性系数0.72水平上，自选材料1、日本品种山木一本与其他类型关系较远。从该数据得知，日本引进大葱品种并没有严格与我国的栽培葱分开，说明我国大葱与日本大葱的亲缘关系很近，或同源性较高，没有因地域差异显示出大的遗传距离。

由表4可知，遗传距离在0～2.11之间，其中遗传距离最小为0(3与13；23与26；29与31)。遗传距离最大值为2.11(1与24)。

表4 大葱31个自交系的遗传距离

3 讨论

研究表明，DNA分子标记可用于葱属植物的品种鉴定、多样性研究、SSR标记的开发、颜色的改良、可溶性固形物含量、雄性不育系和DNA测序等工作[12]。Kutty等利用90个RAPD引物对24个洋葱栽培种进行了分类分析[13]；Xu等利用5个RAPD标记对31个大蒜栽培种进行了分类鉴定[14]；我国学者徐启江等利用ISSR标记对洋葱种质资源进行了遗传多样性分析[15]；高莉敏等开发了与雄性不育相关的大葱SCAR分子标记[16-17]；Khar等利用EST-SSR对短日照热带印度洋葱及其相关变种的种群进行了遗传多样性分析[18]。但利用EST-SSR标记对大葱的栽培种进行多样性分析还少有报道。

有大量研究表明在同属、同科植物间甚至单子叶植物、双子叶植物间的EST-SSR标记均有较高的通用性[19-21]。本研究将洋葱EST-SSR标记应用于尚未大量开发EST-SSR标记的各个大葱栽培类型中，具有很高的通用性。该试验证实洋葱EST-SSR标记在大葱不同栽培类型上的通用性比率为92.86%，为大葱分子标记辅助选择提供了一些可行的 EST-SSR 引物，降低了单独开发大葱EST-SSR引物的成本。本研究为大葱遗传作图、遗传多样性分析、功能基因定位和克隆等提供了有效途径，同时，也为大葱种质资源收集、保存、评价及优良种源筛选奠定了基础。

引物的多态性条带不仅能说明引物的多态性，同时也能反映一个群体的遗传变异程度[22-26]。本研究所用的13对 EST-SSR引物共检测到28个等位基因位点，平均每条引物2.15个。此结果说明该大葱群体的遗传多样性程度相对较低。这可能是由于大葱食用、药用等价值较大，多年来人类有目的性地种植，造成有些基因型丢失，遗传背景不断趋于单一化，导致形成了较低的遗传多样性。此外，为深入分析大葱不同栽培种的遗传多样性，开发新的EST-SSR标记势在必行。