慢性阻塞性肺疾病中糖皮质激素抵抗的分子机制研究进展

石建邦 吴健卫

(九江市第一人民医院呼吸内科，江西 九江 332000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病，其气流受限多呈进行性发展，与气道和肺组织对烟草烟雾等有害气体或有害颗粒的慢性炎性反应增强有关。糖皮质激素作为主要的抗炎药物，广泛地应用于COPD患者治疗中，但仍不能有效的控制炎症反应，甚至对一部分COPD患者是无效的，所以需要更有效的抗炎药物及联合治疗。在很多细胞类型中，肺部炎症及其释放的促炎症细胞因子影响糖皮质激素受体(GR)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)2和表面活性蛋白(SP)-D的活性。巨噬细胞、中性粒细胞、呼吸道上皮细胞和淋巴细胞与诱导糖皮质激素抵抗有着密切的联系。本文对COPD患者及动物模型中糖皮质激素抵抗的分子免疫学机制的研究进展进行综述。

1 炎症反应在COPD中的作用

香烟烟雾暴露的肺上皮细胞产生大量的过氧化氢和超氧化物自由基，并激活肺泡巨噬细胞，促进细胞凋亡；暴露于香烟烟雾的肺发展为肺气肿，即使戒烟后，肺实质破坏仍不可逆〔1～3〕。暴露在香烟烟雾中的小鼠和人类的支气管肺泡灌洗液(BAL)中蛋白含量增加，呼吸道上皮细胞增生，肺泡毛细血管通透性增强〔4，5〕；呼吸道上皮细胞、肺泡巨噬细胞，平滑肌细胞和成纤维细胞被激活并释放大量的细胞因子和炎症趋化因子，而吸烟者较戒烟者有更多促炎性细胞因子〔6～8〕。COPD患者血清、痰液及支气管肺泡灌液中的白细胞介素(IL)-27和IL-33水平升高，而它们的表达水平与疾病的加重有关〔7，9〕。研究表明，COPD患者肺组织中主要以中性粒细胞浸润为主，其他包括单核细胞浸润，CD4+和 CD8+淋巴细胞，从而导致肺部炎症、肺组织的破坏及气道重塑〔10〕；活化的中性粒细胞和肺泡巨噬细胞释放多种促炎性细胞因子、趋化因子和其他调节因子，例如髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-6、IL-17、单核细胞趋化因子(MCP)-1，趋化因子(C-C基序)配体(CCL)2、趋化因子(CXC亚家族)配体(CXCL)2、CXCL5、CXCL8。大量产生的基质金属蛋白(MMP)-9能分解肺组织细胞外基质成小肽，随后被T细胞识别，引起T细胞的活化和浸润〔11〕。巨噬细胞由经典激活巨噬细胞(M1细胞)和替代性活化的巨噬细胞(M2细胞)组成，在COPD肺组织中有变异的巨噬细胞表型，而他们大多数是作为中间表型〔12〕。与当前吸烟的COPD患者相比，终止吸烟的COPD患者CD163+M2型巨噬细胞的百分比增加，但巨噬细胞总数降低，这表明终止吸烟能影响巨噬细胞的表型及相关功能〔13〕。COPD吸烟者中M2型巨噬细胞占主导地位，其特征为高表达MMP-2、MMP-7和腺苷A3受体(ADORA3)〔14〕。

CD4+和CD8+T细胞通过释放干扰素(IFN)-γ、TNF-α、丝氨酸蛋白酶和颗粒酶B在COPD发病机制中发挥着重要作用。然而，COPD急性加重与循环中CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例呈负相关，但与肺组织内T淋巴细胞浸润呈正相关。这种差异可能是由于外周循环中T细胞向炎症部位迁徙和循环中T细胞的凋亡引起数量下降〔15〕。COPD患者支气管刷检标本中CD8+T细胞数量和TNF-α的表达增加〔16〕，在体外用IL-18和IL-12刺激肺源性 CD8+T细胞，可导致分泌大量IFN-γ和TNF-α〔17〕。敲除CD8基因的小鼠长期暴露于香烟烟雾并未导致肺气肿，同时肺部炎症和细胞因子的表达明显降低，这表明CD8+T细胞在COPD发病机制中发挥着重要作用〔18〕。体外研究表明，CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和NK T细胞(NKT)通过抗CD137抗体能有效减少外周血单核细胞中的IFN-γ、TNF-α和颗粒蛋白酶B〔19〕。因此，T淋巴细胞在COPD的发病机制中有着重要的作用，通过分子干预抑制T淋巴细胞的活化和细胞因子的表达可能成为COPD治疗的方法。

暴露于香烟烟雾后，气道浸润的巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、NKT细胞和γδT细胞表达的IL-17A明显增加〔20〕。作为IL-17A的主要来源，Th17细胞在肺部炎症反应也发挥了重要作用。在COPD患者外周血及肺泡灌洗液中，Th17细胞数量明显增多，同时Th17细胞的数量与IL-17水平与疾病的严重程度有关〔21，22〕。相反，在COPD患者中抑制性T淋巴细胞、细胞因子及调节因子明显降低〔23〕。因此，COPD进展与促炎症反应的增强有关，且能减弱抗炎反应。

2 炎症反应在糖皮质激素抵抗中的作用

吸入性糖皮质激素(ICSs)已经成为控制COPD患者症状一种主要的抗炎药物。研究表明，中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞参与诱导糖皮质激素抵抗〔24，25〕。在吸烟或戒烟患者中，短期糖皮质激素治疗不能降低痰液中的中性粒细胞及支气管中的CD8+T细胞；吸入高剂量ICSs能够控制部分症状，但容易导致肺炎、糖尿病、声音嘶哑及其他并发症〔26，27〕。与糖皮质激素敏感患者相比，糖皮质激素抵抗患者体内有更多的IL-8、MMP-9、磷脂酰肌醇3激酶δ、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和糖皮质激素受体β；相反，在糖皮质激素抵抗患者中，HDAC2和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸酶1 的活性明显减弱〔11，25〕。在糖皮质激素抵抗COPD患者的肺泡巨噬细胞中，泼尼松不能抑制由脂多糖(LPS)诱导的IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、MCP-1和MMP-9的上调〔7〕。因此，炎症反应不仅参与COPD的发病机制，还能诱导糖皮质激素抵抗。中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞有助于激素抵抗的产生，因此，在克服激素抵抗的分子干预中，这些细胞是潜在的靶细胞。研究表明，与其他药物联合治疗更能有效地提高激素敏感性。趋化因子(CXC亚家族)受体(CXCR)2 拮抗剂、磷酸二酯酶4抑制剂(RNO)、p38MAPK抑制剂和抗IL-1及IL-17抗体可通过作用于中性粒细胞提高激素敏感性〔11，28〕。其他药物〔如合成的罗格列酮、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ激动剂(10-硝基油酸、茶碱、磷脂酰肌醇3激酶δ抑制剂)〕能有助于抑制暴露于香烟烟雾的巨噬细胞释放多种促炎细胞因子〔29〕。

3 GR亚型在糖皮质激素抵抗中的作用

炎性细胞因子通过调节参与糖皮质激素信号通道的多种蛋白的表达及活性降低激素敏感性。GR的表达和活性对激素介导的抗炎功能至关重要。GR是一种细胞内受体，与热休克蛋白(HSP)90成对存在。当GR结合到糖皮质激素后，HSP90被释放从而促进GR成熟及与糖皮质激素反应元件(GRE)的结合。GR包括GR-α和GR-β两个亚型。GR-α主要聚集在细胞质中，能够通过上调核因子(NF)-κB抑制物(IκB)-β和直接结合NF-κB抑制促炎NF-κB的活性。NF-κB通过上调组蛋白乙酰化酶(HAT)的活性及形成NF-κB/HAT复合物产生促炎反应。当GR-α被激活后，GR-α能够通过募集HDAC2形成复合体，抑制NF-κB/HAT复合体的形成，其后导致在主要促炎因子的启动子区的组蛋白去乙酰化〔30〕。相反，GR-β含量较少，可以直接与GRE结合〔31〕。因此GR-β 认为是GR-α拮抗剂，可以减弱GR-α的抗炎活性。在外周血单个核细胞和其他细胞类型中，TNF-α、IL-1β、IL-17和IL-23能上调GR-β的表达〔32〕。研究表明，在暴露于香烟烟雾提取物后肺泡上皮细胞和巨噬细胞GR-α的表达和活性明显降低〔29〕。另外，在COPD患者的CD8+CD28+/-T细胞中GR活性降低或丧失，与此同时，从T细胞和NKT样细胞释放的INF-γ 和TNF-α明显增加。因此，GR亚型影响着激素敏感性，在肺泡巨噬细胞和T淋巴细胞中，可通过上调GR-α和下调 GR-β提高激素敏感性〔33〕。

4 GR的翻译后修饰在糖皮质激素抵抗中的作用

研究表明，例如磷酸化、乙酰化和小泛素样修饰(SUMO)1等不同的翻译后修饰影响的GR活性〔30，34〕。多种刺激物(如促炎性细胞因子、氧化应激)均通过翻译后修饰调节GR活性。HSP90对GR的稳定性和成熟有着重要作用。在生理条件下，HSP90和辅助因子p23与GR成对存在，防止GR降解。然而，氧化应激可促进HSP90乙酰化，从而减弱HSP90的保护作用。HDAC6是一个重要的去乙酰化酶，在氧化应激条件下，HDAC6酶活性降低，HSP90乙酰化增加。另外，GR的活性亦受翻译后磷酸化的影响。不同部位残基的磷酸化导致GR活性有差异〔35〕。在ser211残基的磷酸化可促进GR的核运输和转录活性，而在ser226和ser203残基的磷酸化能促进出核转运和抑制核转运〔36〕。IL-2和IL-4是 GR磷酸化的强诱导剂。在支气管哮喘和克罗恩病的激素耐受患者的PBMC和上皮细胞中，GR的磷酸化增强与降低GR的结合功能和核转运活性有关，p38MAPK和转录因子2被激活。

除了GR磷酸化对GR活性有重要作用外，异常的GR乙酰化影响GR活性和激素敏感性。在生理条件下，GR活性与每天的血清糖皮质激素水平呈反比，一个均衡的GR活性对抵抗循环中昼夜波动糖皮质激素的生物学作用是至关重要的。昼夜节律基因钟与脑和肌肉芳香烃受体核转运蛋白(BMAL)1形成蛋白复合体，并通过影响GR的乙酰化控制GR的昼夜活性〔37〕。香烟烟雾暴露的小鼠，BMAL1的表达及活性均降低，随后降低GR活性。在BMAL1基因敲除小鼠吸入LPS后，激素敏感性明显降低〔38〕。SIRT1是第三类组蛋白去乙酰化酶，是BMAL1和其他中间调节因子的激活剂。在氧化应激时，SIRT1的活性受到抑制，从而使BMAL1活性降低〔39〕。

5 HDAC类在糖皮质激素抵抗中的作用

与SIRT1类似，HDACs是一类重要的去乙酰化酶，参与许多转录因子、受体及组蛋白的生物活性的调节，其表达水平及活性与促炎和抗炎效应有关。目前HDACs根据其结果与功能分成Ⅰ类(1，2，3，8)、Ⅱ类(4，5，6，7，9，10)和第四类(11)，不同类型的HDACs有不同的活性〔40〕。HDAC7是促炎因子，并提高Toll样受体(TLR)-4依赖的IL-12p40和IL-6的表达〔41〕；而HDAC6和HDAC11通过抑制抗原递呈细胞(APC)中IL-10基因的表达发挥促炎作用〔42〕。相反，HDAC2和HDAC3通过抑制促炎因子的表达发挥抗炎作用。在免疫应答中，NF-κB被激活并与环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)结合蛋白(CBP)形成蛋白复合物，募集组蛋白乙酞基转移酶促进组蛋白乙酰化和促炎基因的转录，例如TNF-α、IL-8和IL-1β等。HDAC2和HDAC3通过在靶基因的启动子区组蛋白的去乙酰化降低HAT活性，并通过紧缩染色质降低转录活性〔24，30，40，43，44〕。此外，HDAC2提高肺泡巨噬细胞的吞噬功能并促进病原体的清除；因此，HAT与HDAC2的平衡对有效地抑制炎症反应是非常重要的〔45，46〕。

HDAC2在诱导激素抵抗中有着重要的作用。在COPD患者和吸烟者的肺泡巨噬细胞中，HDAC2明显减少，且其活性与疾病的严重程度与加重有关〔24，30〕。暴露于香烟烟雾可减少巨噬细胞HDAC2的表达，但促进NF-κB依赖的促炎因子的表达，例如IL-8和TNF-α〔47〕。在COPD患者和吸烟者外周血单个核细胞(PBMCs)中，HDAC2表达明显降低〔48〕。氧化应激是HDAC2减少的一个主要因素。在巨噬细胞中，一氧化氮和过氧化物通过转录后修饰降低HDAC2的活性。暴露于香烟烟雾可通过在巨噬细胞样细胞的单胱氨酸(Cys)262和Cys274残基s-硝基酪氨酸修饰大大降低HDAC2的活性〔24〕。HDAC2水平的下降是诱导COPD患者的激素抵抗一个主要因素。低乙酰化GR可以有效地抑制含NF-κB和衔接蛋白复合物(AP)-1的蛋白质复合物的形成。氧化应激可通过转录后修饰降低HDAC2 和GR的活性，但氧化应激是否通过其他去乙酰化酶调节GR活性仍是未知的。最近，调节HDAC2活性已经被认为是治疗炎症性疾病的一个主要策略，同时可改善激素敏感性。茶碱是HDAC的一种有效的活化剂，同时能够提高COPD患者的激素敏感性。在COPD患者急性加重时，低剂量茶碱能够显著抑制NF-κB活性，同时降低痰液中TNF-α、IL-6和IL-8的水平。肺泡巨噬细胞是HDAC2激活剂的主要靶细胞。莱菔硫烷是转录因子核因子相关激活因子(Nrf)2的一个小分子激活剂，能通过提高HDAC2活性恢复激素敏感性。予以莱菔硫烷治疗后，激素抵抗的COPD患者肺泡巨噬细胞对激素治疗的敏感性明显增加〔24〕。这认为与促进Nrf2与抗氧化基因的抗氧化反应元件的结合及提高抗氧化蛋白(如血红素氧合酶-1)的合成有关〔49〕。抗氧化蛋白能通过诱导 HDAC2的亚硝基化提高其活性，各种抗氧化剂，如中草药、水果、饮食中的多酚类已经被用于治疗自身免疫性疾病及炎症性疾病。它们同时可通过恢复HDCA2活性提高激素敏感性。

6 SP-D在COPD中的作用

在生理和病理条件下，SP-D在调节先天性和获得性免疫性反应中发挥着重要作用。SP-D通过与病原体及细胞碎片的相互作用，促进与肺泡巨噬细胞的结合，提高巨噬细胞的吞噬作用和促进炎症减退〔50〕。另外，SP-D在感染性肺组织中能抑制获得性免疫反应，从而避免过度的炎症反应导致肺组织的损害〔51〕。SP-D可通过与抗原递呈细胞上的树突状细胞的凝集素受体(DC-SIGN)和跨膜受体信号抑制调节蛋白(SIRP)-α发挥免疫调节功能。

COPD患者和吸烟者血清中SP-D水平明显升高；相反，在肺组织中SP-D水平下降，但在吸入糖皮质激素治疗后这是可逆的；血清SP-D水平与症状严重程度相关，因此血清SP-D水平目前被认为是COPD发病风险的一种生物标志物〔52〕。糖皮质激素、TNF-α、IL-4、 IL-6和IL-13等多因素影响SP-D水平，糖皮质激素可上调SP-D水平。在氧化应激下促进肺上皮细胞和内皮细胞的凋亡，使肺泡毛细血管屏障通透性增加，从而导致肺SP-D漏入血液循环中，引起血液中SP-D含量的增加〔4〕。在LPS诱导的大鼠肺损伤中，氧化应激状态下的Ⅱ型肺泡上皮细胞可能下调SP-D的表达，但不能仅仅由改变基因的表达、转运及其他可能参与其过程的机制来解释SP-D表达的下调。COPD患者中，氧化应激可能影响SP-D的生物学功能。多聚体结构能够促使SP-D有效的与其受体结合，然而氧化应激能够将多聚体装饰成单体结构，而后者既没有功能又有促炎及炎症趋化作用〔53〕。因此，氧化应激可能通过改变SP-D的表达及生物学功能促进肺部炎症反应。鉴于SP-D在调节肺部炎症反应中的作用，在COPD和肺部其他炎症相关性疾病中，肺部SP-D的减少能够诱导激素抵抗。所以，在吸烟者和COPD患者中，调节SP-D的表达及活性可能成为一个控制肺部炎症反应和提高激素敏感性潜在方法。