丁酸梭菌的培养、鉴定、检测方法研究进展

2019-01-09张吉鹍

中国奶牛 2019年6期

张吉鹍

（湖北博大生物股份有限公司，黄石 435000）

1 丁酸梭菌活菌制剂是禁抗之后重要的肠道保健剂

对营养物质进行消化、吸收并发挥免疫调节作用，是动物肠道的重要功能。所以，进行肠道保健、维持肠道健康，尤其在禁抗之后，就显得非常必要。目前，市场上有关肠道保健的产品很多，主要以酸化剂、益生菌、中短链脂肪酸等为主，而中草药及其提取物、精油、寡糖、纤维、酶制剂、谷氨酰胺等产品亦发挥着重要作用。就目前的动物生产实践看，所有这些方案中微生态（益生菌）制剂是重要的替抗方案之一。所谓微生态制剂（Probioties），又叫益生菌制剂（Probiotics）、活菌制剂（Bigone）。它是运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌，经特殊工艺制成的制剂，对动物具有整肠作用，能够较好地防治动物便秘、炎症、腹泻，并对动物的生长具有较好的促进作用。丁酸梭菌制剂既产芽孢又产酸，具有芽孢杆菌制剂与乳酸菌制剂的优点，作为活菌制剂稳定性较好，不需包被即能耐受胃酸与胆汁酸以及外界（制粒、贮存等）不良条件，是禁抗之后重要的肠道保健剂之一。

2 丁酸梭菌的培养

大规模生产下丁酸梭菌制剂的菌体生物量低，是制约其在动物生产中推广普及的主要因素。常用的培养丁酸梭菌的方法有固态培养法、响应面法、混合培养法等。

2.1 固态培养法

谢全喜等[1]建立的丁酸梭菌固态培养方法，其关键点在于培养基的优化与发酵条件的优化。经优化的培养基组成为：豆粕:麸皮为1:1，氯化钙0.2%；经优化的发酵条件为：72h、37℃、接种量5%。所生产的丁酸梭菌活菌数可达2.2×108cfu/g。余国莲等[2]提出适合丁酸梭菌制剂大规模生产的最佳培养条件：培养基起始pH 7.3、温度37℃、培养时间24h、接种量3%；最适培养基组成为：葡萄糖10g、豆粕15g、玉米粉7g、硫酸镁0.2g、硫酸铵0.2g、磷酸氢二钾0.5g、碳酸钙0.3g、蒸馏水1 000mL。

2.2 响应面法

响应面法（Response Surface Method），又称响应曲面法，是通过对响应曲面及等高线的分析寻求最优工艺参数，采用多元二次回归方程来拟合响应值与因素之间函数关系的一种优化统计方法，其优点是在实验条件优化过程中可以连续地对实验因素的各个水平进行分析，克服了正交实验[3,4]只能对一个个孤立的实验点进行分析和不能给出直观图形的缺陷，所以被广泛应用于微生物发酵条件的优化和模型的建立[5,6]。徐莹等[7]利用响应面法优化丁酸梭菌清液发酵工艺，将丁酸梭菌的生物量由6.96×107cfu/mL提高到3×108cfu/mL。孔青等[8]采用中心组合实验（Central Compose Design,CCD）优化丁酸梭菌淀粉培养基，最终将生物量提高到2.55×108cfu/mL。李雯静等[9]对从健康羊粪便中提取到的一株具有良好益生特性和抗逆性能的羊源丁酸梭菌（命名为HDRyYB1菌株）的发酵工艺进行了优化，其发酵培养基组分（质量体积比）为：面粉3.72%、鱼粉0.90%、米粉3.96%、酵母粉0.60%、NaCl 0.19%、MgSO4·7H2O 0.19%、KH2PO40.01%、NaHCO30.01%、CaCO30.48%；其培养参数为：37℃，初始pH7.2～7.4，瓶装量100/250，接种量3%。经此优化后，HDRyYB1菌株发酵完全（18h）的芽孢数可达1.478×108cfu/mL，是优化前的2.7倍。经李雯静等[9]优化用于发酵的培养基，具有两个显著特点：一是以米粉、面粉等淀粉质原料作为碳源，来源广，价格便宜；二是以鱼粉、酵母粉等有机氮作为氮源，蛋白质、多肽和游离氨基酸的含量丰富，不仅为丁酸梭菌的快速生长提供了营养，也为丁酸梭菌后期芽孢的快速产生提供了营养。试验表明，丁酸梭菌经18h时培养后芽孢完全成熟，这为进一步用于大规模生产提供了数据支撑。邢宏观等[10]首先采用单因素试验设计法，即利用Plackett-Burman试验设计，筛选出影响丁酸梭菌菌体数的显著性因素，从而对影响丁酸梭菌生物量发酵液的相关组分进行初步优化；然后在此基础上，运用最陡爬坡试验找出中心组合设计的中心点，并确定可降低生产成本的非显著因素的最低添加量；最后运用响应面分析法进一步优化丁酸梭菌的发酵配方，从而获得最佳发酵培养基的组成成分，并确定最佳培养条件。其试验结果表明，酵母浸粉、FeSO4与K2HPO4是影响菌体数量的3个显著性因素；最佳培养基组成为：可溶性淀粉2%、酵母浸粉6%、FeSO41.74%、K2HPO40.37%、NaCl 0.2%、MgSO40.024%；其菌体数可达1.01×109cfu/mL，较优化前的2.3×108cfu/mL提高了4.39倍。

2.3 与酵母菌混合培养

丁酸梭菌是一种严格厌氧菌，培养时对氧极其敏感。生产中常采用往培养基中添加还原性耗氧剂如谷胱甘肽还原盐或者依靠厌氧生物反应器来达到厌氧的目的。邓庆等[11]结合动物生产实际，对丁酸梭菌的培养方法进行了创新，首次采用生物除氧（如将酵母菌与丁酸梭菌混合培养）的方法培养丁酸梭菌。酵母菌为兼性厌氧菌，易于培养且生长迅速，在动物生产中的应用较悠久。酵母的营养价值高，不仅富含蛋白质（约占酵母干物质总量的一半），且富含人体必需氨基酸，尤其是富含谷物食品、饲料中较为缺乏的赖氨酸。此外，还含有大量的维生素B1、维生素B2及尼克酸。所以，酵母作为常用的饲用益生菌，不仅可以为饲养动物提供营养，还能预防和治疗动物的肠道损伤。邓庆等[11]比较了添加无机还原除氧剂硫代硫酸钠、有机还原除氧剂半胱氨酸和丁酸梭菌与酵母菌混合培养3种方法对提高丁酸梭菌的生物量的影响。发现：①随着除氧剂添加量的增加，除氧效率不断提高，当硫代硫酸钠和半胱氨酸的添加量达到0.004g/mL时，丁酸梭菌的生物生长量分别达到最大值3.49×108cfu/mL与4.24×108cfu/mL；当除氧剂的添加量超过0.004g/mL时，反而抑制丁酸梭菌的生长（原因是除氧剂不能持续地除氧，到培养末期其除氧效果几乎为零）。②以酵母膏胨葡萄糖为培养基，丁酸梭菌与酵母菌按不同比例接种后混合培养可产生正组合效应。当丁酸梭菌与酵母菌的体积比为3:7、其相应的生物量比为0.517时，组合效应值最大，此时丁酸梭菌的生物量可达到5.238×107cfu/mL，酵母菌的生物量为1.68×106cfu/mL。

3 丁酸梭菌的鉴定

3.1 菌株富集与分离纯化

欧阳志周等[12]将从不曾使用过任何抗生素及微生态制剂的仔猪肠道内容物中采集的样品（1g）放入100mL富集培养基蓝盖瓶中，在80℃热激10min，用水冷却后置于37℃恒温培养箱富集培养3d，挑选有大量气泡生成的培养液，进一步在富集培养基中进行富集，传代5次后，将检测到有丁酸生成的发酵液转接到分离培养基继续发酵培养。取富集培养的发酵液在厌氧培养箱里梯度稀释到10-8，利用滚管技术方法分离单菌落。李永峰等[13]则是将样品于37℃静置富集培养，采用亨盖特滚管法对乙酸产量高的富集物进行分离纯化。

3.2 形态学观察

在进行丁酸梭菌的形态学观察时，先将鉴定为丁酸梭菌的菌株进行扩大培养，然后在TSN琼脂平板上观察其菌落形态。欧阳志周等[12]在对分离到的丁酸梭菌进行形态鉴定时，依据《常见细菌系统鉴定手册》[14]中规定的方法，利用芽孢染液染色、镜检。选取菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定。

3.3 生理生化特征分析

由于丁酸梭菌隶属梭菌属，鉴定丁酸梭菌时可根据《常见细菌系统鉴定手册》[14]和《伯杰细菌鉴定手册第8版》中鉴定梭菌属的方法，采用光学显微镜以及扫描电镜观察细菌的显微结构，然后结合生理生化试验，对菌株鉴定到属。

3.4 菌株16S rDNA 序列分析

李清扬等[15]采用Hungate厌氧操作技术，从东北地区土壤中分离到一株产耐低温淀粉酶菌株C-9，经形态、生理生化、16S rDNA 序列分析，鉴定为丁酸梭菌。李圣杰等[16]对从鸡小肠表面黏液中分离到的既产酸又高产淀粉酶的菌株进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，确定该分离菌株为丁酸梭菌。迟雪等[17]对从猪牛粪堆肥、玉米地土壤和腐木混合物的富集样品中分离到一株降解纤维素的厌氧产丁酸菌，经16S rDNA序列分析等鉴定为丁酸梭菌。胡小红等[18]从窖泥中分离到一株能利用乳酸产丁酸的菌株BEY8，基于16S rDNA基因序列分析鉴定为梭菌属。樊晓璐等[19]采用厌氧培养法从朗姆酒发酵过程添加的丹多液中分离到9株纯菌株，经生理生化实验和16S rDNA序列分析从中鉴定出1株丁酸梭菌Y-1。王腾浩等[20]采用厌氧培养法进行菌种分离，孔穴琼脂扩散法进行抑菌活性筛选，并通过形态学、生理生化特性和16S rDNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定，筛选出产高效抑菌蛋白的丁酸梭菌ZJU-F1。欧阳志周等[12]用梭菌强化培养基厌氧培养从仔猪肠道内容物中分离获得的菌株，将其确定为梭菌属（厌氧条件下产芽孢），再通过16S rRNA同源性分析进一步确定该分离菌株为丁酸梭菌，命名为C. butyricum QL-1。

3.5 将多种方法集成，进行整体鉴定

丁酸梭菌自身的特点决定了现有的单一鉴定方法在其鉴定过程中不可能获得准确的鉴定结果，为准确鉴定丁酸梭菌，目前倾向于将表型（菌落形态和革兰染色等）、生化（API 20A和VITEK2等）、16S rRNA序列分析与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）等技术进行集成，进行全面的整体鉴定以获得最终鉴定结果[21]。鉴定周期长是目前梭状芽孢杆菌鉴定的主要问题，荧光PCR法在细菌鉴定领域的普及，极大地节省了鉴定的人力物力，并缩短了试验周期。董银苹等[22]针对梭状芽孢杆菌基因序列中属的特异性与种的特异性基因设计引物和探针，优化荧光PCR法反应参数与反应条件，并用标准菌株、分离株和牛奶样品对方法的准确性与灵敏度进行验证。发现所建立的梭状芽孢杆菌鉴定用荧光 PCR法在属和种的鉴定上均有较好的准确性和灵敏度，可用于梭状芽孢杆菌的快速、准确鉴定。

4 丁酸梭菌所产芽孢数量的检测

丁酸梭菌为极其严格的厌氧菌，对培养条件要求非常苛刻，特别是在固体培养基上培养时，生长效果极差。若采用常规的灭活营养体再通过涂布平板法计算芽孢数量不但培养周期长，而且试验结果误差大，不具可行性。因此，要准确测定丁酸梭菌所产芽孢的数量是一个极富挑战性的难题。邢宏观等[10]通过测定丁酸梭菌所产芽孢中特定的物质2,6-吡啶二羧酸（DPA）的含量来间接测定丁酸梭菌所产芽孢的数量。DPA为仅存于芽孢中的一种特有物质，占芽孢干重的5%～14%[23,24]，因此，完全可以通过测定DPA含量来间接测定芽孢含量。DPA含量的测定主要有荧光显色法[25]、质谱法[26]、化学显色分光光度法[27]和高效液相色谱法[28]等。邢宏观等[10]比较了分光光度法、荧光显色法和高效液相色谱法3种方法，发现高效液相色谱法较其他两种检测方法的灵敏度更高，最后决定采用高效液相色谱法来测定芽孢中DPA的含量，并参照Fichtel[29]一文中所测定的梭菌属单个芽孢DPA含量标准（每个芽孢中DPA的含量大概为2.2×10-16mol）将最终DPA浓度换算成芽孢数。