高通量测序技术结合传统方法筛选及鉴定奶酒中曲霉菌

林少华，罗红霞 ，贾红亮，句荣辉，王建，李星宇

（北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442）

近年来，由于奶酒含有人体必需的营养元素，且具有驱寒活血、开胃消食及降低胆固醇等功效[1]，越来越受到人们的关注。奶酒是以动物乳、乳清或乳清粉等为主要原料，经发酵等工艺酿制而成的饮料酒[2]。然而，奶酒产业的发展仍处于初级阶段，受到很多因素的制约，尤其是发酵菌株的筛选等方面的研究起步较晚[3]，这在很大程度上影响着奶酒的工业化生产。目前，奶酒菌株的分离和筛选多采用传统的可培养方法，如贺银凤等人[4]从内蒙古锡盟不同地区采集的奶酒样品中分离纯化鉴定了球菌5个属，杆菌6个属，酵母菌6个属。吴敬[5]在锡林郭勒盟收集的奶酒中分离出47株乳酸菌，分别归类为乳杆菌（Lactobacillus）、粪肠球菌（Enterococcus ceails）、坚强肠球菌（Enterococcus durans）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）、假鸟肠球菌（Enterococcus pseudoarium）和肠膜明串珠菌葡聚糖亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp.dextranixum）。Mu等[6]从内蒙古、新疆和青海采集到96份奶酒，获得655株酵母菌，分属12种酵母，分别是近邹褶假丝酵母（Candida pararugosa）、异常德克拉酵母（Dekkera anomala）、地丝菌属亚种（Geotrichum sp.）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、单孢酿酒酵母（Kazachstania unispora）、马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、毕赤酵母（Pichia deserticola）、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、曼氏毕赤酵母（Pichiamanshurica）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）、酿酒酵母（Saccharomyces erevisiae）和球拟酵母（Torulaspora delbrueckii）。

尽管可培养方法是微生物中最常见的研究方法，但这种方法得到的微生物信息比较有限，对微生物体系的认识存在一定的局限性。最近发展起来的高通量测序技术为分析复杂的微生物体系提供了一种高效便捷的方法，能够获得微生物群落中的全部微生物的遗传信息，因此，可用于奶酪、白酒、泡菜等发酵食品微生物体系的分析[7～10]。本研究采用高通量测序技术对奶酒中的真菌群落进行研究，并结合传统的可培养方法对真菌群落的曲霉属进行分离和鉴定，为奶酒的微生物分离与鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶酒，采自内蒙古锡林郭勒盟牧区；三羟甲基氨基甲烷，美国Amresco公司；宏基因组DNA提取试剂盒25T/50T，北京福德安科技（北京）有限公司；10×PCR buffer、dNTP、rTaq DNA聚合酶、上样缓冲液6×Loading Buffer，宝生物工程（大连）有限公司；引物，上海生工生物工程有限公司；2000bp marker，赛默飞世尔科技公司；真菌基因组DNA提取试剂盒D3390-02，OMEGA公司。

1.2 仪器与设备

ZQJ-254型紫外强度计，上海顾村电光仪器厂产品；短波紫外线保鲜照射箱，国家农产品保鲜中心（天津）产品；超低温冰箱，Sanyo（MDF-382E）；超净工作台，北京王堂蓝翼科技有限公司；小型离心机，Sigma（1-14）；低温高速离心机，Eppendoff（Centrifuge 5804 R）；PCR扩增仪，BioRad（ALD1244）；定量PCR仪，BioRad（CFX96）；凝胶成像仪，UVP（GelDoc-It Imagine System）；高通量测序仪，Illumina（Miseq）。

1.3 试验方法

1.3.1 高通量测序

（1）基因组DNA的提取：按照DNA提取试剂盒的说明提取奶酒真菌总的DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。

（2）PCR扩增及测序：对真菌的ITS 1区域进行扩增。PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用1× TAE浓度为2%的琼脂糖胶电泳纯化PCR产物，然后割胶并使用GeneJET 胶回收试剂盒回收目标条带。使用New England Biolabs公司的NEB Next® UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用HiSeq进行上机测序。

（3）数据处理：根据拆分出的样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7）对样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始数据（Raw Data）；然后对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据（Clean Data）。通过QIIME（V1.7.0）的质量控制流程，得到Tags序列，与Gold database数据库进行比对检测嵌合体序列，并去除其中的嵌合体序列，从而得到最终的有效数据。

（4）OTUs聚类：利用Uparse 软件（Uparse v7.0.1001）将样品的有效数据进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），同时选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选出OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA的SSUrRNA数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8～1），获得分类学信息并分别在各个分类水平上统计各样本的群落组成。

1.3.2 曲霉菌的分离纯化

用平板稀释法将奶酒样品在麦芽汁琼脂培养基上于2℃培养3～7d，挑取形态与曲霉菌相似的菌落通过平板划线进行分离纯化，通过显微镜进行观察。确认为曲霉菌的就接种到麦芽汁琼脂培养基上，进行分离纯化2～3次。

1.3.3 菌株的16S鉴定

（1）细菌基因组DNA抽提：使用真菌基因组DNA提取试剂盒，按步骤操作，提取出细菌基因组DNA，保存备用。

（2）引物序列：ITS 1，TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS 4，TCCTCCGCTTATTGATATGC。

（3）PCR扩增：反应体系为10×Ex Taq buffer，5.0μL；2.5mM dNTP Mix，4.0μL；10p Primer 1，2.0μL；10p Primer 2，2.0μL；5u Ex Taq，0.5μL；Template，2.0μL；ddH2O，36.5μL。反应条件为预变性，94℃ 3min；变性，94℃ 30s；退火，60℃ 30s；延伸，72℃ 1min；从变性到延伸循环35次。

（4）切胶纯化测序：紫外灯照射下观察琼脂糖凝胶，对含有目的基因DNA的比较亮的条带进行切割回收，纯化，后用测序仪进行测序。

2 结果与分析

2.1 样品测序数据分析

经过数据前处理，奶酒样品总的DNA经测序分析得到47 147条有效序列数据，序列的长度为200～466bp之间，平均长度为409bp。从奶酒中真菌的稀释曲线（图1）可以看出，随着测序数量的增加，它们所能代表构建的OTUs数量也增加，但是曲线的斜率先上升后变得平坦，说明本测序的数据量是合理的，能够反映样品中微生物群落的种类和结构。

图1 奶酒样品中真菌测序的稀释曲线

2.2 属分类水平上的菌群样本组成分析

经过分析比对已得的OTUs，共鉴定到3门11纲19目26科39属。经在属的分类水平上进行分析（图2），真菌分布丰度占比前十位的属分别为酵母菌属（Saccharomyces）、曲霉属（Aspergillus）、念珠菌属（Candida）、根霉属（Rhizopus）、干酪酵母菌属（Meyerozyma）、链孢霉属（Neurospora）、毛孢子菌属（T r i c h o s p o r o n）、棒状孢菌属（Corynespora）、节担菌属（Wallemia）、镰刀菌属（Fusarium）。其中，酵母菌属（Saccharomyces）的丰度约为62%，为第一丰度的属。酵母菌属是一种形状呈细胞圆形、椭圆形或柱形的无性繁殖的单细胞生物重要真菌，能发酵葡萄糖、麦芽糖等糖类产生酒精，在酿酒工业中有着重要应用。丰度占比第二的为曲霉属（Aspergillus），比例约为33%。曲霉属中部分菌种可将淀粉质原料转化成葡萄糖，而且糖化力强，繁殖速度快，热稳定性良好，耐酸，耐酒精，不产或少产可降低甲醇生成量的果胶酶。由于它们具有酶系丰富，产酶活性高，生长速度快，适应能力强，易于管理等特点，是酿酒微生物的重要组成部分，因此，本文将对其进行下一步的分离与鉴定。

图2 基于属分类水平上的奶酒样品菌群分布图

2.3 分离与鉴定

将经过分离后的菌株进行16S鉴定，得到样本的拼接序列，通过NCBI数据库比对，结果为Aspergillus sp.，因此，本研究成功地分离出目标菌株。

3 结论

奶酒营养丰富，具有一定的保健功能。通过高通量测序技术，能够从全貌上了解其微生物的群落结构。本文通过测定奶酒的真菌生物多样性得知，酵母菌属（Saccharomyces）和曲霉属（Aspergillus）是奶酒最主要的真菌群落，其中，酵母菌属（Saccharomyces）为第一丰度的真菌，丰度约为62%。第二丰度的真菌为曲霉属（Aspergillus），丰度为33%。根据试验需要，通过进一步分离并采用16S鉴定出了曲霉菌，为下一步开发奶酒发酵剂提供了理论依据。