线粒体调控先天性免疫机制研究进展

毛旭明，孙英杰，武 玮，谢 军，丁 铲，吴艳涛

（1.扬州大学兽医学院，扬州 225009；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3. 西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

线粒体是真核细胞中一种重要的具有双层膜结构的细胞器，除了成熟的哺乳动物红细胞和某些单细胞生物之外，线粒体几乎存在于所有真核生物细胞中。线粒体最先被发现也是最重要的功能是通过呼吸链产生能量，即三磷酸腺苷（ATP）。ATP产生最重要的通路是三羧酸循环，线粒体内膜上的大量蛋白质参与了这一过程，因此线粒体被认为是细胞的动力工厂。线粒体另一个重要的功能是储存细胞中的钙离子，线粒体能够迅速摄取钙，并稍后释放，线粒体的这种瞬时储存钙的功能有利于维持细胞内的钙稳态[1]。细胞中游离钙的浓度可调节一系列反应，对细胞中的信号转导至关重要，由线粒体膜电位驱动的钙释放可以激活一系列第二信使，协调神经细胞中的神经递质释放和内分泌细胞中激素释放的过程[2]。除此之外，线粒体还在其他一些细胞代谢中发挥重要作用，例如：线粒体活性氧介导的信号转导、细胞凋亡、激素信号传导等。近年来，随着线粒体抗病毒蛋白（mitochondrial antiviral-signaling protein, MAVS，又称IPS-1, VISA,CARDIF）的发现[3-6]，越来越多的证据显示线粒体在先天性免疫中发挥重要的作用，本文就线粒体如何参与抗病毒先天性免疫进行了综述。

1 线粒体动力学和抗病毒免疫

病毒感染细胞时，先天免疫系统通过几种类型的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）快速识别病毒，这些识别病毒的PRR主要包括Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）和RIG-I（retinoic acid-inducible gene I）样受体（RIG-I like receptors，RLR）。TLRs（例如TLR7和TLR3）位于细胞膜或细胞内体的膜上，识别病毒的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）后招募接头蛋白（例如MyD88和TRIF），导致下游信号通路的激活，产生I型干扰素（IFNs）和趋化因子[7]。RLR（例如RIG-I和MDA5）是细胞质中识别病毒的模式识别受体[8-9]。这些胞质解旋酶含有两个N端串联的半胱天冬酶招募结构域（caspase recruitment domain，CARD）[8,10]，RLR识别病毒后会发生构象变化导致CARD域的暴露，与下游线粒体接头蛋白MAVS的CARD结构域产生互作，随后激活下游的两种细胞质蛋白激酶复合物，一种包括“非经典”IKK-相关激酶TBK1或IKK-i/ε和一系列接头蛋白例如TANK、NAP1和NEMO。这种TBK1复合物负责激活转录因子IRF3的磷酸化和二聚化，IRF3转位至细胞核中，诱导I型IFN基因的表达。另一种激酶复合物包括IKKα、IKKβ和NEMO，这种IKK复合物激活NF-κB，促进下游促炎性细胞因子的表达，参与先天性抗病毒反应[5,8]。

用Poly（I: C）刺激MAVS缺陷小鼠无法引起IFN产量上升，RNA病毒感染MAVS缺陷小鼠后导致免疫反应严重受损[11-12]，这些结果说明MAVS在抗病毒先天免疫中发挥关键作用。MAVS如何参与介导抗病毒先天免疫信号传导的具体机制尚不清楚，但重要的是，MAVS必须定位于线粒体才能发挥其功能[5]，说明MAVS的信号传导依赖于线粒体的状态。与之相对应的是，MFN1作为一种线粒体融合蛋白，能够正调控MAVS介导的天然抗病毒反应[13-15]。进一步研究结果显示，MAVS能与MFN1发生相互作用，RLR激活后，MFN1-MAVS复合物调控线粒体上MAVS的重新分配以及线粒体的管网状延伸[14-15]。尽管MAVS再分配的功能尚不明确，但线粒体的管网状延伸能够增强MAVS与STING的互作，促进细胞抗病毒反应[14]。STING是位于内质网膜的抗病毒信号接头蛋白，在DNA病毒诱导的先天性免疫中发挥重要作用[16]。与MFN1相反，其同源蛋白MFN2却能够抑制MAVS功能，这可能与线粒体动力学无关[17]。可见，尽管MFN1和MFN2在线粒体融合方面具有相似的功能，但它们在抗病毒先天免疫方面似乎起着相反的作用[13]。MFN1和MFN2除了对线粒体融合的调控外，还能够与各自的伴侣分子在线粒体外膜上进行同型和异型互作，以确保对MAVS介导信号传导的精细调控。

MAVS介导的抗病毒信号传导不仅受线粒体动力学的调控，同时，NLRX1[18]和gC1qR[19]两种线粒体蛋白被证实通过抑制MAVS阻断RIG-I和MDA5介导的抗病毒反应。有趣的是，最近一项研究报道显示线粒体膜电位（ΔΨm）也能调控RLR介导的先天性免疫通路[20]。用质子载体CCCP处理或在MFN1和MFN2缺失的细胞中ΔΨm丧失，明显阻断了RLR介导的抗病毒先天免疫应答，但对TLR3的激活没有影响。ΔΨm在MAVS介导的信号传递中的具体作用还不明确，有报道认为ΔΨm的丧失可能会阻止MAVS复合体的重组，而MAVS复合体的重组能为病毒感染提供更迅速的反应[20]。此外，ΔΨm的丧失还有可能阻止MAVS与STING的互作[14,16]。这些证据证明线粒体动力学和ΔΨm似乎都参与了MAVS介导的先天性免疫，但是将线粒体最重要的功能ATG合成抑制却并不阻断MAVS介导的信号传导，说明MAVS的功能不依赖于线粒体的能量供应。

除了直接调控之外，线粒体还能够通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）间接调控先天免疫信号通路，例如NF-κB和JNK途径，以及caspase 1炎性小体[21]。细胞内活性氧的两个主要来源是线粒体和膜相关的NADPH氧化酶（NOX）与双重氧化酶（DUOX）复合物。NOX2和ROS对MAVS介导的抗病毒信号传导至关重要。研究结果证实NOX2下调能降低MAVS的mRNA表达水平，而不影响其线粒体定位[22]。

2 线粒体作为先天免疫的平台

MAVS作为RLR通路的枢纽接头蛋白定位于线粒体外膜，且MAVS发挥功能依赖其线粒体定位，首次证实了线粒体在先天免疫信号通路中发挥重要作用。越来越多的证据证明许多宿主抗病毒免疫反应都依赖于线粒体，许多参与细胞免疫反应的分子均与线粒体关系密切，例如NLRP3、TLR等。

2.1 NLRP3 NLRP3是一种重要的NLR（NOD样受体），在病原相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）诱导caspase 1炎性小体过程中发挥重要作用

[23]。NLRP3上游激活物的多样性导致了NLRP3能识别由PAMP和DAMP触发的信号，而不是直接识别单独的分子（蛋白质或核酸等）。这一点依然存在争论，因为证据表明溶酶体损伤或者ROS可以直接作为NLRP3的激动剂。最初发现由NADPH复合体产生吞噬体相关ROS能激活NLRP3[24]。另有报道显示，细胞中NADPH氧化酶依赖的ROS产生通路受阻能够导致NLRP3通路激活[25]。有研究认为线粒体可能是激活NLRP3的ROS的主要来源，为这些相互矛盾的结果提供了可能的解释[26]。他们发现鱼藤酮和抗霉素这两种药物能够阻断线粒体呼吸链，导致线粒体ROS的生成，从而有效激活NLRP3。类似地，抑制自噬能导致产生ROS的缺陷线粒体积累，而该线粒体又能增强NLRP3依赖炎症小体的激活。线粒体作为一种分子平台，在NLRP3激动剂处理后能招募NLRP3中的几个炎性小体成员，包括NLRP3本身和接头蛋白ASC[26]。但是产生ROS的线粒体如何招募NLRP3炎性小体的机制目前仍然未知，对线粒体锚定相关复合物如何参与NLRP3炎症小体形成还有待进一步研究。

2.2 TLRs 吞噬细胞吞噬细菌后导致多种先天免疫信号通路的激活并杀死微生物。ROS的产生是消灭微生物的一种最古老而有效的手段，它通过上调位于吞噬体表面的NADPH氧化酶复合物，从而实现与吞噬作用的功能互联。TLR信号能增强NADPH氧化酶活性，而由该复合物产生的ROS能增强TLR介导的炎症途径[27]。最近一项研究表明线粒体也可能在吞噬相关的ROS生成和TLR信号转导方面起着关键作用。细胞表面TLRs包括TLR1、TLR2和TLR4的配体，能激活鼠巨噬细胞产生线粒体衍生的ROS，而内体上的TLRs包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的配体则不能激活鼠巨噬细胞产生ROS[28]。有趣的是，当细胞吞噬了包被Pam3CSK4（TLR2配体）或LPS（TLR4配体）的乳胶微球后，细胞中线粒体聚集在含有乳胶微球的吞噬体附近，而当乳胶微球包被CpG DNA（TLR9配体）时，则没有观察到类似的现象。由此可以推断微生物的吞噬和TLR识别导致吞噬体周围线粒体的聚集和局部ROS产生，这有助于消除被吞噬的微生物。进一步研究结果表明，TRAF6是TLR信号通路中至关重要的E3连接酶，在TLR1/2/4配体（而非TLR3/9配体）处理细胞后转运至线粒体，而线粒体ECSIT蛋白被鉴定为TRAF6的泛素化靶标蛋白，而该泛素化由TLR1/2/4配体特异性激活。线粒体中TRAF6-ECSIT通路的激活对线粒体在吞噬体附近的特异性定位以及线粒体ROS的诱导至关重要。这些研究显示了线粒体ROS在吞噬微生物方面的重要性，TRAF6-ECSIT通路的例子说明线粒体在先天性免疫中发挥着枢纽作用[28]。

2.3 NLRX1 NLRX1是NLR家族成员中唯一一个具有N末端线粒体定位序列的蛋白，该区域被命名为字母“X”[18,29]。生化分析结果显示NLRX1定位于线粒体基质[30]。值得注意的是，NLRX1是目前已知的唯一的靶向线粒体的PRR家族成员，暗示了NLRX1可能是连接线粒体和先天免疫之间的重要“桥梁”。然而NLRX1的线粒体定位特征表明其似乎并不能直接识别微生物来源的分子标记。因此，NLRX1的确切功能尚不明确。NLRX1的过表达能诱导ROS的产生[29]，可能原因是NLRX1与UQCRC2发生互作，而UQCRC2是线粒体呼吸链复合体Ⅲ的重要组分，在ROS生成中具有关键作用[30]。有趣的是，NLRX1被证明也能与MAVS互作，抑制MAVS依赖性的抗病毒反应[18]。但是，NLRX1具体如何与MAVS互作仍不清楚，因为这两种蛋白质定位于不同的由双层膜隔离开的线粒体亚结构域。有研究认为NLRX1进入线粒体依赖一定程度的内膜ΔΨm[30]，ΔΨm的损耗将导致NLRX1在细胞质中滞留，滞留在细胞质中的NLRX1与MAVS互作并抑制其介导的信号通路，这一假设还有待进一步证实。首先需要确定病毒感染能否诱导NLRX1在胞质中的滞留。另一种可能性是NLRX1通过产生ROS影响RLR信号传导，而ROS已经被证明能调控MAVS依赖的信号通路[22]。

2.4 IRGM IRGM是一种细胞中广泛存在的人类鸟苷三磷酸酶，在先天免疫抵抗细胞内病原方面发挥作用[31]。许多鼠源IRG基因由干扰素调节，而人源只存在两种直系同源基因IRGM和IRGC。IRGM最初被认为是一个假基因，后来被发现在人类巨噬细胞清除结核分枝杆菌过程中发挥作用[32]。已经证明IRGM在雷帕霉素、饥饿和IFNγ诱导的细胞自噬限制结核分枝杆菌方面至关重要[32]。IRGM介导自噬的机制尚不清楚，但最近来自Deretic团队的一项研究显示线粒体在这个过程中发挥重要作用。IRGM聚集于线粒体并调节线粒体分裂，这一机制在自噬泡调控细胞内病原过程中发挥作用[33]。 IRGM对线粒体的定位取决于IRGM与心磷脂的相互作用，心磷脂是主要在线粒体内膜中被发现的一种线粒体脂质。另外，对IRGM mRNA剪接突变体的研究结果表明，IRGM异构体的过表达能诱导线粒体分裂，线粒体去极化和自噬依赖细胞死亡，导致主要的促炎激动剂HMGB1的释放[33]。总之，线粒体的动态调节似乎是决定IRGM在先天免疫中介导自噬（细胞存活）和凋亡或坏死（细胞死亡）这种双重功能的重要因素。

3 线粒体DNA对先天性免疫的调节

有观点认为，线粒体可能是从一种能与宿主细胞共生的古细菌进化而来，因此，线粒体DAMP（mDAMP）可以被认为是介于DAMP和PAMP之间的分子模式。线粒体作为细胞中特殊的细胞器，有自身的组成元件，如细胞色素c、甲酰肽和线粒体DNA（mtDNA）。在长期的进化过程中，细胞利用这些元件作为mDAMP来防止线粒体损伤。其中细胞色素c从线粒体内膜释放到细胞质中后，能够与APAF1相互作用，诱导caspase-9依赖的细胞凋亡[34]。

mtDNA是另一种重要的mDAMP，在细胞经历非正常死亡（例如病理学损伤）后释放并激活一系列先天性免疫通路，最近有报道显示线粒体中释放的mtDNA能够激活TLR9、NLRP3和STING等一系列先天性免疫信号通路[35-37]（图1）。

在细胞损伤和应激（例如阳离子载体）后，线粒体释放的mtDNA能够激活内含体中的TLR9，导致促炎性细胞因子基因的转录和促炎细胞因子的释放，包括MMP-8、TNF-α、IL-6和IL-1β[35,38]。此外，mtDNA在疱疹病毒感染后释放至细胞质中，随后被cGAS-cGAMP-STING通路识别，导致TBK1-IRF3依赖的I型IFN通路激活并抑制病毒复制[37,39]。有趣的是，登革热病毒作为一种RNA病毒，同样能够诱导mtDNA的释放和cGAS-cGAMPSTING通路的激活，说明RNA病毒似乎也能间接激活DNA受体cGAS介导的信号通路[40]。但也有研究显示，登革热病毒的NS2B蛋白能够靶向降解cGAS，抑制mtDNA介导的cGAS通路的激活[41]。因此，RNA病毒通过诱导mtDNA释放激活cGAS通路还有待进一步研究证实。此外，ATP的刺激能够诱导线粒体功能障碍，mtDNA释放到细胞质中结合并激活NLRP3炎症小体，而NLRP3炎症小体募集和激活caspase-1，可将IL-1β和IL-18前体切割成生物活性形式。另一方面，微管相关蛋白1轻链3B（LC3B）/ Beclin 1介导的细胞自噬参与了mtDNA的清除，从而负调控NLRP3炎性小体的活化[36,42]。

4 展望

越来越多的证据表明，线粒体除了在细胞代谢过程和细胞死亡中发挥重要作用，还是先天免疫信号激活的关键平台。目前仍有很多问题尚待解决：为什么细胞中有众多细胞器，唯独线粒体与先天性免疫关系如此密切？其中一种解释是线粒体上存在多种先天免疫途径分子；另一个可能的原因为线粒体是细胞内ROS的主要来源，在许多方面有助于宿主防御病原体。另外，为何是mtDNA，而不是基因组DNA能够被宿主cGAS通路识别？cGAS通路如何分辨mtDNA和基因组DNA？目前针对病毒的防控主要停留在分子水平，通过对线粒体与抗病毒先天性免疫的研究，能够为我们从细胞器水平进行病毒防控提供新策略。