外泌体在系统性红斑狼疮中的研究进展①

向清勇 万伟国 刘佳滟 王令彪 邹和建 杨 雪

(复旦大学附属华山医院风湿免疫科，复旦大学风湿免疫过敏性疾病研究中心，上海200040)

外泌体(Exosomes)是一种能被细胞主动分泌到胞外的微小囊泡，可存在于血液、尿液、唾液以及乳汁等多种体液中，其直径约为30～100 nm，密度为1.13～1.21 g/ml，外泌体表面具有脂质双层膜结构并内含细胞特异性的蛋白、脂质和核酸等生物活性物质，能保护其包被物质的同时，也能靶向特定的组织和细胞发挥其生物学功能[1]。同时不同细胞分泌的外泌体具有不同的组成成分并发挥不同的功能，可作为细胞间通讯、疾病治疗的重要载体以及疾病诊断和预后的重要标志物。

1 外泌体的形成过程、表面标志及功能

首次关于外泌体的报道是1983年Pan等[2]在羊的成熟网织红细胞中发现该细胞可释放的一种膜性小囊泡，最初这种小囊泡被认为是用来排出多余的转铁蛋白受体。1987年[3]这种小囊泡被命名为外泌体，进一步的研究提示其由胞内途径生成，目前较为公认的外泌体形成过程是细胞内陷形成早期胞内体，在内吞体转运复合物(ESCRT)及相关蛋白的调控下，早期胞内体的界膜多处凹陷，向内出芽形成管腔状囊泡，进而转变为亚细胞结构的多泡小体(MVBs)，MVBs最后在膜转运相关蛋白(GTPase)家族中的RAB酶的调节下与胞膜融合以出芽方式向胞外释放形成外泌体[4,5]。

外泌体几乎可以由所有种类的细胞分泌，并存在于人体各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，外泌体可通过膜转运相关蛋白GTPases、CD63、CD81及CD82等作为体外检测及筛选的指标。外泌体中还富含微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)及蛋白等[8]。

2 不同免疫细胞来源外泌体的研究

免疫细胞作为机体发挥免疫功能的重要载体，传统认为主要通过细胞接触及细胞因子及抗体分泌等机制发挥调节作用，随着近年来对细胞外泌体及其作用的逐渐认识，免疫细胞的作用机制也得到了更新和发展。

2.1 固有免疫 固有免疫细胞主要包括单核巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞(DC)及NK细胞等。目前研究较多的是巨噬细胞和DC细胞来源的外泌体。细菌感染后的巨噬细胞来源的外泌体具有免疫调节作用，其分泌的外泌体可刺激巨噬细胞及中性粒细胞分泌TNF-α、RANTES等促炎因子[9,10]；并通过TLR途径刺激受体细胞[11]。人巨噬细胞分泌的外泌体携带合成白三烯B4和白三烯C4酶，可促进粒细胞的迁移[12]；而LPS刺激巨噬细胞产生的外泌体能有效减轻完全弗氏佐剂(CFA)注射后的小鼠足掌肿胀及减轻CFA诱导的炎性疼痛相关的热痛觉过敏[13]，发挥抑炎作用；中性粒细胞来源的外泌体能迅速被气道平滑肌(Airway smooth muscle,ASM)细胞内化，并改变其增殖特性；被LPS刺激后的中性粒细胞来源的外泌体可增强ASM细胞的增殖，导致病情加重和对激素不敏感哮喘患者的气道重塑[14]。DC来源的外泌体可以被上皮细胞吸收，并且促进上皮细胞分泌炎症介质(MCP-1、IL-8、TNF-α、RANTES)的释放，提示外泌体促进免疫炎症反应[15]；同时有研究显示DC可通过其衍生的外泌体抑制小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)的发生并降低其严重性，主要通过产生indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)和IL-10 发挥免疫抑制作用[16,17]；提示同一细胞来源的外泌体在不同的微环境中发挥不同的免疫调节作用，外泌体也是一把“双刃剑”，需要我们在不同的疾病和不同的微环境中对其功能进行认识，不能一概而论。

2.2 适应性免疫 适应性免疫细胞主要包括T、B淋巴细胞。传统认为参与细胞免疫的T淋巴细胞主要通过分泌细胞因子(IFN-γ、IL-13、IL-17、IL-21)发挥免疫调节作用；现有研究表明，在T细胞中，Wahlgren等[18]证实被相关抗体(IL-2、anti-CD3、anti-CD28)刺激的T细胞所产生的外泌体可作为自身信号物质调节初始T细胞的分化，用自身外泌体刺激的初始T细胞可导致CD4+T的增加、CD8+T的降低；T细胞产生的富含microRNA的外泌体可单向转移至B细胞和抗原提呈(APC)细胞中，其中由MHC Ⅱ类分子参与形成的免疫突触在此过程中发挥重要作用[19]，而CD8+T细胞分泌的表达FasL的外泌体对肿瘤细胞的凋亡和增殖影响不大，但可通过Fas/FasL途径促进B16和3LL癌细胞的体外侵袭[20]。调节性T细胞(Treg)是目前研究相对较多的T细胞亚群，研究表明Treg来源的外泌体表达免疫调节分子(CD25、CD73、CTLA4)，具有免疫抑制作用，可以调节效应T细胞的增殖和细胞因子的分泌从而调节免疫应答[21]。Okoye等[22]研究表明Treg来源的外泌体及其中的let-7d基因能够抑制Th1细胞的增殖和IFN-γ的分泌。抑制性T细胞来源的外泌体通过抑制效应性T细胞的增殖和诱导调节性T细胞影响巨噬细胞，其中活性氧中间体(ROI)参与了抗原特异性耐受机制[23]；而Th17细胞及滤泡辅助性T(Tfh)细胞来源的外泌体研究目前尚未见相关报道，有待进一步的研究。

B淋巴细胞主要通过分泌抗体来实现其体液免疫的调节功能，现有的研究表明B淋巴细胞可释放表达MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子、CD80、CD86、CD54的外泌体，与抗原提呈相关分子有着同样的功能，可将抗原提呈给淋巴细胞，实现CD4+T细胞的激活[24]；而人类B细胞衍生的淋巴母细胞系(Lymphoblastoid cell lines,LCL)可组成性地产生MHCⅡ+FasL+表达的外泌体诱导CD4+T细胞的凋亡[25]。总体来说，B细胞来源的外泌体表达及功能的相关研究目前仍较有限，有待进一步的研究及应用。

现有的研究结果表明，对T、B淋巴细胞分泌的外泌体及其功能的研究较为有限，尤其结合到某一个具体的自身免疫性疾病，T、B淋巴细胞分泌的外泌体对淋巴细胞本身的自分泌及对全身其他免疫细胞及靶细胞的旁分泌作用如何？有多大程度参与及发挥免疫作用？以及对疾病的调节作用及作用机制如何？仍有待于进一步的探索和研究。

3 外泌体在系统性红斑狼疮中的相关研究

系统性红斑狼疮是临床常见的自身免疫病，其发病机制尚未完全清楚，但机体中的淋巴细胞存在明显的紊乱。在SLE中，凋亡小体清除能力的缺陷和代谢产物的累积是自身抗原的主要来源[26]，特异性的外泌体及其内含物质作为SLE病情活动和预后进展的生物标志物，在系统性红斑狼疮的研究中得到越来越多的关注和重视。

现有研究表明，SLE患者中外泌体水平显著高于健康人群，且SLE患者的外泌体能够在体外Toll样受体存在的条件下促进 IFN-α、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，缺乏外泌体的SLE患者血清或者外泌体被破坏后则不能促进细胞因子的产生，提示血清中外泌体水平升高且可作为狼疮活动度的指标[27]，同时，也提示我们外泌体参与了细胞因子的产生和释放；Nielsen等[28]的研究显示内皮细胞来源的囊泡数量与狼疮的疾病活动度、肾小球肾炎和血管功能异常密切相关，内皮来源囊泡的表型可作为狼疮相关血管病变的特异性生物标志；Parker等[29]的研究进一步证明使用免疫抑制治疗后可减少循环中内皮细胞来源的囊泡数量并降低心血管疾病的风险，但内皮来源的囊泡本身是否也参与了这些靶细胞和靶器官损伤值得进一步的研究；Ostergaard等[30]的研究则提示在狼疮患者外周血中存在特殊的囊泡谱，与正常人或类风湿关节炎患者比较具有差异且存在微管和细胞骨架成分减少，但这些特殊的囊泡的来源细胞目前也尚不明确；Nielsen等[31]证实狼疮患者循环中的外泌体IgG、 IgM、 C1q的表达比健康人外泌体中的表达有所增加，并且与血浆 IgG、 抗dsDNA抗体、 抗ENA抗体、抗组蛋白抗体的浓度及低水平的白细胞呈正相关，因此认为外泌体是SLE自身免疫性抗原的来源之一，更有效地引起相应抗体的产生，参与SLE的发病机制并调控疾病活动性。除外泌体本身，其中富含的并且被转移至细胞外的miRNA、lncRNA和蛋白成分，也可作为评估临床疾病的有效指标；据报道miR-146a在狼疮患者PBMCs、血浆和血清中均低表达，可能有助于SLE患者的1型干扰素(IFN)途径的改变[32-34]，但在LN患者的肾小球组织中miR-146a则高表达[35]。

狼疮性肾炎(LN)是临床SLE的常见并发症，肾脏受累的患者中有10%～30%可进展为终末期肾病[36]，因此，研究新的生物标志物早期评估肾小球损伤，避免有创活检已经成为临床亟待解决的问题。尿液是新型生物标志物的理想生物液体，Pisitkun等[37]对尿液中的外泌体进行鉴定和表型分析，证实尿液外泌体可作为稳定的miRNA生物标志物的来源。Solé等[38]研究发现尿液外泌体中MiR-29c的水平和LN患者肾脏病慢性化指数呈负相关，但是与肾功能指标无明显相关性，这一发现为LN患者提供了一个预测肾脏纤维化进程的非侵入性指标的可能，亦有研究表明成熟miRNA在尿液外泌体中的分布高于尿液的其他成分；同样miR-146a也受到了研究者关注，研究表明活动期狼疮肾炎患者尿液外泌体中miR-146a表达明显升高；另在肾小球疾病及LN患者的尿液外泌体中发现黏附分子ADAM10的蛋白水平较高，可作为早期肾小球疾病的生物学标志[39]。

尽管近年来外泌体在狼疮中的研究有一些新的进展，但仍较有限；已有的研究主要把外泌体作为评估疾病活动度及肾脏受累的指标。但随着研究的进展，我们发现外泌体不仅仅作为疾病活动和脏器受累的指标，它同时也是疾病发生发展中的重要调节因子和/或致病因子，借助其可通过体液循环到达全身的特点，在不同的微环境下发挥不同的生理/病理、促炎/抑炎的双向调节作用。而在以免疫功能失调为疾病特点的系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中，外泌体作为新的治疗载体或靶点具有良好的前景和潜力，值得进一步的关注和探索。

4 结语

目前，外泌体在肿瘤、炎症等方面的研究较多，但在系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的研究仍较有限。现有的研究结果表明，外泌体在疾病预测、靶向治疗等方面具有很大的潜能，外泌体中的相关物质如miRNA等也可作为病情预警、诊断、评估的重要指标以及有望作为后续治疗的可靠载体。但外泌体确切的病理生理功能及其作为治疗靶点的作用和机制需要进一步的研究阐明及验证。研究的最终目的是将外泌体应用于临床，因此需要更优化的细胞来源及更安全有效的治疗性外泌体及外泌体成分。希望通过对外泌体研究的不断深入，为系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的诊断和治疗提供更多的选择和帮助。