流式细胞术最新进展及临床应用①

程小艳 武会娟

(北京市理化分析测试中心，北京市基因测序与功能分析工程技术中心，北京 100094)

流式细胞术(Flow cytometry，FCM)，临床上也被称为流式细胞分析，是利用流式细胞仪同时对单个细胞的多个参数进行定性/定量(相对/绝对)分析的生物医学分析技术,检测速度快、通量高、灵敏度高、采集数据量大、节约样本及成本，在临床上已经广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、精子学等检验领域，是未来临床检验不可替代的检测方法之一。

传统流式细胞术，也被称为荧光流式细胞术，是基于荧光标记及荧光发射光谱检测的一门综合性技术，定量方式多为定性分析，检测参数类型单一、数目有限，数据分析复杂且缺乏标准化分析流程，不同检测中心间数据重现性差，这些都限制了它在临床检验中进一步的推广及应用。近年来，为克服以上问题，流式细胞术不断突破与创新，从定性检测发展为定量检测；从单参数分析、双参数分析发展成为多参数分析；从检测细胞表面抗原到胞内抗原及分泌到胞外的抗原；从检测蛋白表达水平发展为检测蛋白定位、蛋白功能及蛋白翻译后修饰等；从一维定量检测发展为二维定量定位分析，从体外检测发展为体内检测等；这些突破使得流式细胞术可以实现从单细胞水平去认识细胞在生理或病理状态下的免疫表型、分子表型甚至各种复杂的信号通路变化等，因此将更为广泛应用于临床检测。

1 定量流式细胞术

定量流式细胞术(Quantitative flow cytometry,QFCM)，即通过流式细胞仪定量检测细胞或微球上荧光素的中值荧光强度(Median fluorescent intensity，MFI)或每个细胞结合的抗体单位(Antibodies bound to per cell,ABC)来对生物分子进行相对或绝对定量的流式细胞技术。定量流式细胞术已被证明是一种功能强大的临床检验技术，但由于MFI缺乏标准化度量方法，容易引起不同检测中心检测结果重现性差，导致诊断和治疗决策的不确定性及不可靠性，限制了其在临床的推广应用，因此，标准化MFI测量为流式细胞术实现精确定量分析，在临床广泛应用的必经之路。目前，在临床应用过程中，为提高检测结果的准确性及重现性，定量流式细胞术必须做到以下几点：①样本及试剂处理严格按照标准操作规程，每一次检测必须设置质控管；②流式细胞仪维护及校准。每一次检测前进行仪器校准；③检测流程标准化及规范化；④数据分析自动化。流式检测数据量庞大，分析难度大，经验性强，人工分析存在主观性和低保真度等特点。实现机器操控及数据分析的标准化、自动化将会大大提高检测数据的再现性及可靠性。

2 多色流式细胞术

多色流式细胞术(Multicolor flow cytometry,MFC)是指利用超过三种的荧光素实现多个参数同时检测的流式细胞技术。近年来，随着流式细胞仪硬件(激光管、滤光片等)、软件(数据分析等)的不断改进，荧光素的不断开发及应用，临床诊断领域的不断发展及需求，MFC应运而生。大部分临床检验中心的流式细胞仪具备2～3个激光器，可以同时检测9～10色荧光，甚至出现了5激光20参数同时检测的流式细胞仪。多色流式细胞术可以快速准确高灵敏的检测细胞内多个指标，实现从复杂样本中识别罕见细胞群，为疾病诊断、药物开发等提供了强大的工具，是流式细胞术未来发展的主要趋势，也是流式细胞术在临床应用的主要方向。但由于结果分析的复杂性，MFC目前在临床应用中还主要是作为探索或辅助手段。例如，吴江等[1]利用多色流式细胞术分析急性 HIV 感染者外周血γδT细胞的表型，探索哪一种γδT 细胞在急性 HIV 感染及疾病进展中发挥重要作用。流式细胞术评分系统经常被整合到疾病诊断和预后评分系统中，辅助精细评分。例如，基于CD79b(或CD22)、CD23、CD5、FMC7及SmIg检测的流式细胞术免疫分型评分参与辅助诊断慢性淋巴细胞白血病[2]；利用MFC检测骨髓祖细胞侧向角散射光、CD117表达以及单核细胞CD13表达等参数建立的流式检测积分系统可以补充目前的骨髓增生异常综合征国际预后评分系统(IPSS-R)，实现更为精确的预后评估[3]；利用MFC检测分析来自骨髓的造血细胞的免疫分型可以辅助慢性髓细胞白血病的诊断、预后和治疗[4]；利用MFC检测白血病细胞表面分化抗原可以辅助白血病分型诊断及白血病微小残留物诊断[5]；基于GPI锚连蛋白缺失检测的MFC可以辅助阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断；基于多种分子标记物[血小板特异性膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ、GPⅠa/Ⅱa等)、血小板颗粒膜糖蛋白(CD62P、CD63、CD107a、CD107b等)]、Ca2+流及RNA含量等检测的MFC可以辅助血小板功能分析等[6]。

3 磷酸化流式细胞术

磷酸化流式细胞术(Phospho-specific flow cytometry，Phospho-flow)，是指高通量检测单个细胞内多个磷酸化蛋白的流式细胞术。细胞信号通路中关键因子的磷酸化水平是细胞信号转导研究的重要内容，而经典的生化方法对信号通路的分析非常有限，因为它不仅只能一次检测一个蛋白的磷酸化水平，并且获得的结果为一群细胞内蛋白磷酸化水平的平均值，这一方面无法实现细胞内信号网络的全面分析，另一方面在面对异质细胞群体时也很难获得准确的结果，而磷酸化流式细胞术很好地克服了这些难题，它借助于多种信号分子的磷酸化抗体，在单个细胞水平上同时分析细胞内多个蛋白因子的磷酸化水平，从而获得更高水平的信号转导动力学，实现单个细胞内信号通路的全面分析。

Phospho-flow已经广泛应用于多个领域，包括抗原或微生物刺激下免疫应答过程中的信号通路研究、癌症及自身免疫性疾病相关信号通路研究、疾病相关标记物及药物的高通量筛选等。例如：利用Phospho-flow检测CD3阳性T细胞中的核糖体S6蛋白磷酸化水平来进行心脏移植患者mTOR抑制剂依维莫司治疗药物的监测[7]；利用Phospho-flow检测肝移植患者外周血单核细胞(PBMCs)中p70S6K磷酸化水平来评估西罗莫司药效学敏感性[8]；利用Phospho-flow测定主动脉瓣狭窄小鼠模型中的循环白细胞和血小板-白细胞聚集体(PLA)中的Smad2/3磷酸化水平来探究TGF-β1活化在该病发病中的作用[9]；利用Phospho-flow筛选JAK2抑制剂fedratinib(FED)在急性髓系白血病(AML)患者体内的应答的生物标志物，筛选出STAT5磷酸化水平作为具有高特异性和强阳性预测值的药物生物标志物等[10]。

4 流式微球分析技术

流式微球分析技术(Cytometric bead assay，CBA)，指利用类似于细胞大小的微球(如聚苯乙烯微球、磁性微球等)作为载体，以流式细胞仪作为检测平台，对液体中可溶性成分进行高通量快速分析的一门新技术。传统的CBA技术的工作原理是将多种捕获抗体包被在具有不同荧光强度的微球上形成捕获微球，与待测样品溶液混合后，微球上包被的抗体就与样品中对应的抗原结合，再加入荧光素标记的检测抗体，形成类似“三明治”的检测复合物，采用流式细胞仪进行检测，微球上结合的待测抗原或抗体分子数量与其荧光强度呈线性关系，由此可对待测液体中与微球上包被的抗体分子相对应的抗原进行定性或定量分析。CBA是集ELISA和流式细胞技术优点于一身的液相蛋白分析系统，具有检测通量大、样本用量少、速度快、检出限低等特点，为一个高度灵活的多元分析平台，已被用于疾病监测、药物开发、食品安全、环境监测等诸多领域。

近年来，该技术发展迅速，在重复性、检测通量及灵敏度等方面都取得了较大的突破，如今，CBA技术可以实现同一样本中高达70个蛋白的精确绝对定量，检测灵敏度可以达到10-1pg/ml，检测时间仅需要3.5 h。除此之外，在以下两方面也有较大的突破：(1)检测指标类型。传统CBA技术，主要适用于检测具有完全免疫原性的大分子物质。例如：检测微量样本(血液、眼泪、血清、唾液等)中的细胞因子，血浆中炎症因子的水平，细胞信号转导蛋白，凋亡相关蛋白等。例如，Waleed等[11]利用CBA技术检测了中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV感染后T辅助(Th)1、Th2和Th17细胞因子(IFN-γ、IFN-α2、IL-2、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、TNF-α、IL-15和IL-17等)水平；庞盼等[12]利用CBA技术检测细胞因子转化生长因子-β 和白细胞介素-10在布鲁氏菌病(Brucellosis)患者血清中的变化，探究布鲁氏菌感染后的免疫调控机制；近年来，CBA技术在痕量小分子物质(相对分子质量<1 kD)，例如中药小分子成分、真菌毒素、农药残留等的检测方面也取得了快速进展[13]。例如，Xiao等[14]开发了一种基于磁性微球的CBA方法，用于快速及高灵敏度地检测麦芽中的痕量赭曲霉毒素A，检测极限低至0.025 μg/kg。Sandra等[15]开发了同样基于磁性微球的CBA方法，用于可靠且快速的检测同一食物样本中的多种葡萄球菌肠毒素B，为筛选食物中金黄色葡萄球菌和/或肠毒素提供了新的思路与方法。(2)微球类型。传统CBA技术常采用普通聚苯乙烯微球，操作工艺复杂，经过洗涤，离心，偶联和免疫反应等步骤后，微球回收率通常较低，不利于进行多重检测分析。近年来，磁性微球作为相对新型的固体载体，由于具有以下优势而得到了广泛推广及使用。①简化操作流程。基于其磁性，磁性微球可使CBA技术操作流程更加高效、自动化、可并行化及可控；②提高了检测灵敏度和特异性；③磁分离剪切力较低，不会影响抗原-抗体结合和洗涤过程中蛋白质的构象和功能；④可与探针分子结合等。基于这些突破，借助于流式强大的数据分析软件，CBA技术可以实现高通量、高灵敏度及高精确度的定量检测分析,将更为广泛应用于免疫疾病监控、肿瘤研究、药物研发及药效评估、疫苗研究、总体免疫功能分析等众多领域。

5 质谱流式细胞术

传统的荧光流式细胞术是基于荧光发射光谱的检测，但荧光基团发射光谱一般较宽，多参数检测时，不同荧光素发射光谱之间往往会发生重叠，这会导致两方面问题：①检测通量受限；②检测难度提高。为了保证数据精确，多参数检测时必须进行荧光补偿调节，大大增加了检测的复杂性，为传统荧光流式细胞术难以攻克的技术难题，而质谱流式细胞术(Mass Cytometry)恰能很好地解决这一难题。

Mass Cytometry是利用金属元素标记抗体取代了荧光素标记抗体，利用质谱检测取代荧光发射光谱检测的新兴流式细胞术。与荧光流式细胞技术相比，质谱流式细胞技术主要有两点不同： 第一， 抗体标记系统不同。前者使用荧光素作为抗体标记物，后者则使用金属元素作为标记物；理想的标记物需要满足四个特点：①生物样本中含量低；②无放射性；③易于标记及检测；④种类多。金属元素，在细胞中含量极低，且与细胞的非特异性结合少，检测背景低；目前已发现的金属元素种类超过100种，已用于抗体标记的金属元素超过30种，例如钯、铽、钬等。因此，金属元素相较于荧光素具有更多优势，成为细胞标记物极佳的选择。第二，检测系统不同。前者检测系统为激光器和光电倍增管，而后者使用电感耦合等离子体质谱技术ICP-MS作为检测手段。ICP-MS技术，相较于传统分析技术如火焰法、石墨炉法、电感耦合等离子体发射光谱，检出限最低、动态线性范围最宽(ng/L～mg/L)、干扰最少、分析精密度高、分析速度快(1～3 min/样本)，可以同时测定多种元素，分辨率高，相邻检测通道间的干扰小于0.3%， 灵敏度及稳定性也较高，同一样品不同时间检测结果间的变异系数值小于3%。综上，质谱流式技术一方面将检测通道数量提高至几十甚至上百个；另一方面规避了通道间信号的干扰，省略了繁杂的补偿调节，节约了样本和试剂，简化了实验设计及操作流程， 提升了数据可靠性。因此，质谱流式技术，将成为流式细胞分析，尤其是多参数分析的重要发展方向，不仅开启了流式细胞技术的“后荧光时代”，也标志着流式细胞技术进入了一个全新的高通量时代。它将实现更为精确全面的免疫分型及细胞内信号网络分析等，在免疫细胞分型、肿瘤研究等领域有着广泛的应用前景。例如，Korin等[16]在Nature Protocols杂志上发表了利用质谱流式细胞术分析小鼠脑室免疫细胞群的方法，并详细描述了操作流程，包括脑灌注、脑组织提取及其单细胞悬液制备，利用金属标记的抗体进行细胞染色，使用质谱细胞仪读取数据等步骤。整个操作过程仅需要不到5 h(不包括数据分析)，并且指出该方法不仅可以在正常和病理条件下监测大脑免疫群体的变化，还可以推广至脊髓免疫细胞分析等[16]。Schulz等[17]利用质谱流式细胞术检测乳腺癌组织中的3种mRNA靶标分子和16种蛋白质，并指出这种多重检测方法将允许灵活的从患者样本中提取可用于诊断或治疗的目的信息，可以实现更为详细的肿瘤生物学样本研究，并将作为一种全面的基因组学和蛋白质组学分析的工具。

6 成像流式细胞术

流式细胞术的以上进展都停留在“量”这一个维度，研究者获得的细胞信息非常有限，对细胞的了解只基于检测散点图上的一个点，而不是真实的细胞图像，无法获得细胞形态学、检测指标的亚细胞定位等信息，无法更加立体完整地鉴别细胞。成像流式细胞术(Imaging flow cytometry,IFC)攻克了这一技术瓶颈。

IFC集成了流式细胞术及数字显微技术，不仅可以获得细胞群的统计数据信息，还可以实现单个细胞高分辨率的数字成像，实现目的细胞的可视化，获得细胞形态学变化、胞内分子分布变化、细胞间信号传导变化、细胞状态变化等数据信息，实现了全面多维度分析鉴别细胞，为复杂细胞表型检测、罕见细胞(例如肿瘤循环细胞)和过渡状态的细胞(例如有丝分裂阶段细胞)识别、疾病诊断、新标志物挖掘、个性化医疗及药物开发提供了新的可能性。同时IFC继承了两种技术在过去十年中的发展成果，在仪器硬件及分析软件方面均发展迅速，取得了重大进展。Merck & Millipore公司已推出了新一代高速细胞成像系统ImageStreamX MarkⅡ，可以在数分钟内捕获数十万个单个细胞的多通道数字图像，数据分析采用IDEAS®软件，利用所采集的细胞图像对荧光(强度及位置)及细胞形态参数(包括形状、强度、纹理等)等上千种量化参数进行高通量分析，借此形成每个细胞的形态轮廓，然后比较细胞之间的相似性(或相关性)，用以定义细胞亚群或鉴定疾病特异性表型。同时，基于机器学习的开放式高通量IFC数据分析程序已经面市，基于深度学习(Deep learning)的快速图像处理程序也在不断开发，并在鉴定结肠癌细胞、重建细胞周期和疾病进展等方面已经取得了成功，美国食品和药物管理局(FDA)也于2017年批准了第一个临床深度学习应用程序，因此未来IFC数据分析将更加快速、准确[17，18]。

近年来，虽然目前IFC的应用主要集中在科学研究领域，但在临床诊断中也十分有潜力，不仅适合对非黏附或分离细胞进行成像分析，在血液等体液样本成像分析上更具优势，因为这些样本的结构在制备切片过程中会因为涂抹而变形。适用的临床应用领域包括：(1)复杂疾病诊断。复杂疾病的诊断需要基于多个维度信息，例如，传统的急性白血病诊断分型需要结合分析基于光学显微镜的形态学检测数据、基于流式细胞术的表型检测数据以及基于荧光原位杂交的染色体核型分析等遗传信息检测数据，而成像流式细胞术可以集三种分析于一体，为白血病的诊断评估提供了新的思路，并且只需较少的生物标志物，极大地简化实验室样品制备过程，甚至可采用更为理想的无需染色和预处理的血液样品，这将有助于保持样品的完整“原生性”。Erber实验室利用成像流式细胞术实现了悬浮细胞的表型分析及荧光原位杂交，评估了PML小体、核磷蛋白的亚细胞定位、 NPM1基因C末端区域(外显子12)内的突变等在急性髓细胞性白血病(AML)诊断和预后评估中的应用价值[19]；(2)辐射剂量检测。当物理剂量测定方法不存在或受到质疑时，基于生物计量学的辐射损伤标记物分析技术显得更加有效。例如通过双着丝粒(和环)染色体畸变检测(DCA)法定量中期细胞分裂相双着丝粒染色体数目等。但传统生物计量学技术需要借助于显微镜，样本制备耗时、检测通量有限，数据分析繁琐，而IFC可以高通量自动成像和分析血液样本中辐射损伤标记物，检测流程及分析流程均可以生成标准性模板，批量完成检测及数据分析，因此，在大规模放射性/核事件中，IFC可以取代传统基于显微镜的生物剂量学分析技术，用于高通量辐射剂量分析[20]。(3)红细胞生成。红细胞生成障碍会引发多种疾病，例如遗传性贫血，过度增殖性疾病和骨髓增生异常综合征等，开发一种可靠的方法来描述稀有促红细胞生成中间体，才能更好地了解红细胞生成过程。单独利用传统流式细胞术或者显微镜成像技术都面临诸多挑战，包括红细胞中间体免疫表型标记物十分有限，中间体细胞数目稀少并伴随形态学变化，细胞器丢失等，而由于IFC可以整合两种技术，实现同时检测细胞免疫表型及细胞形态学特征，用于描绘与经典组织学分类相关的成红细胞。McGrath等[21]利用IFC将鼠骨髓中的红细胞分成7个亚群，包括4种成红细胞(亲碱性幼红细胞、嗜碱性幼红细胞、嗜多色性幼红细胞、正染色幼红细胞)，含有消除核的白细胞，去核网状细胞和成熟红细胞。

7 体内流式细胞术

体内流式细胞仪(In vivo flow cytometer，IVFC)是一种简单的共聚焦显微镜，基于荧光的IVFC的基本原理与传统的流式细胞仪相似，不同之处在于它利用活体中的天然血管代替传统流式细胞仪中的单一流动鞘。 当荧光标记的细胞通过聚焦在血管上的激光束狭缝时，它可以被激发发出荧光，荧光信号可以被PMT检测到，从而实现实时监测活体动物模型中的荧光标记细胞，成为生物医学研究的一种强大的技术，并具有以下优点：(1)无创。IVFC对体内流动细胞的干扰小。(2)长时间监测。IVFC无需采血，可以实现体内血流中细胞的原位检测，而由于作为生物医学研究中经典的实验动物模型的小鼠，血液量约为2 ml。只允许采集3～10次血液来进行传统的流式细胞仪测量，因此，IVFC更适合进行长时间的延时观察，可以实现细胞群能够连续和长时间的追踪，从而检测其在血液循环中的动态变化。(3)更为敏感的监测异常信号。研究发现，在监测癌症转移时，用IVFC标记绿色荧光蛋白的循环肿瘤细胞的检测效率比常规流式细胞术高1.8倍[21]。

基于这些优势特点，IVFC特别适用于追踪循环系统中的特定细胞，因此已应用于许多领域，尤其是涉及血液循环中细胞的疾病及生物学过程，例如癌症转移，免疫学、纳米粒子检测、生殖医学及干细胞治疗等。下面重点介绍IVFC在肿瘤转移及免疫学监测方面的应用。(1)癌症转移。由于循环肿瘤细胞在癌症发展中很早出现，因此CTC的定量已被认为是癌症诊断和预后中潜在的有力工具，并且研究发现，CTC集群具有比单个CTC更大的转移潜能，因此监测CTC集群对于监测肿瘤转移具有重要价值。IVFC被证明可以实现无创地、持续地监测CTC动态，并可以实现CTC集群计数，在转移性癌症的分期、早期检测和治疗反应监测中都将具有重要价值[22]。(2)免疫学。免疫系统通过从远处，例如淋巴结、骨髓和脾脏等，募集白细胞来响应局部感染或损伤。从这些淋巴器官释放的白细胞通过循环系统流入目的地，因此，IVFC可以实现量化循环白细胞的数量，提供感染或炎症反应的诊断标记，成为非侵入性地监测免疫反应的理想工具。总之，在过去的十年里，IVFC作为直接在血流中检测、计数和表征单个循环细胞的独特方法，发展十分迅速，已经应用于许多重要的临床前研究应用[23]。仪器检测灵敏度、重复利用能力和易用性等方面的持续改进，将促进IVFC领域的持续增长，代表着未来肿瘤学和免疫学的重要的新型临床监测工具。

综上所述，流式细胞术飞速发展，成为无可取代的临床诊断辅助技术，尤其在高通量临床诊断中应用前景可观，但由于缺乏标准化操作流程，数据分析繁琐等问题，仍无法完全取代传统诊断方法，因此，未来流式细胞术只有更加关注操作标准化、数据分析的智能化、批量化等，才能在临床检验诊断中发挥更大的作用。