DNA条形码技术及其在海洋贝类分类中研究进展

刘溪宁，陈睿，孙双祥，张志祥

(宁波市惠贞书院，浙江 宁波 315000)

贝类属于软体动物门，在世界上的分布十分广泛，贝类的种类丰富，目前已知有1.1万余种。物种的分类与鉴定对生物学研究起基础性作用，传统的物种鉴定通过对生物外形特征的比较来鉴定物种。然而，许多贝类生物外形差异并不显著，有些特征可能相重合，甚至会因为环境的诱导而出现趋同进化的现象，从而导致隐种的普遍存在[1]。因此，利用传统鉴定法不仅需要生物学家极高的专业知识素养，而且耗时较长，无法精准地对物种进行分类。随着人们对食品安全的日益重视，以及对维持海洋生态系统稳定性的迫切需要，分类学急需完成较大的突破。

聚合酶链式反应(PCR)技术的出现极大地推动了物种鉴定技术的发展，2003年加拿大生物学家Hebert教授首次提出DNA条形码(DNA barcode)技术[2]。该技术利用特定的短DNA序列将物种进行比对，是效率较高且准确的物种鉴定方法。目前该技术已被运用于鱼类、昆虫类等物种的分类，得到了日益广泛的关注[3]。本文主要对DNA条形码技术在海洋贝类分类中的运用进行综述,探讨利用DNA条形码技术进行海洋贝类分类的可行性与优势，为保护海洋贝类物种多样性提供更加详细的资料。

1 DNA条形码技术的起源、发展与原理

1.1 DNA条形码技术的起源与发展

DNA条形码是使用标准化的DNA标记进行物种准确鉴定的技术，是运用变异较多的和已扩增成功的较短标准DNA条形码片段，在生物种内特异性与种间多样性之间创建的身份鉴定系统，从而实现对物种的快速、高效识别。Arnot等最早提出DNA条形码的概念，但一直到2003年Hebert提出建立一个基于DNA条形码的数据库以实现物种的快速鉴定后，DNA条形码技术才得到了生物学界的普遍认可并得以快速发展[4]。2004年，美国建立了生物信息中心(NCBI)和生命条形码联盟(CBOL)，将物种条形码标准DNA存入了GenBank中，在2009年国际生命条码实施之后，一个基于所有真核生物DNA条形码数据库自动鉴定系统逐步建立。另外，信息技术的发展为海量数据处理提供了工具，推动了DNA条形码技术的标准化使用，生命条形码协会和国际生命条形码计划还创建了大量针对各类群DNA条形码的数据库，如ABBI、All-Lepsh和WoRMS等[5]。

1.2 DNA条形码标记技术的原理与所选材料

DNA是由4种碱基(A、T、G、C)按照一定的顺序构成的基因序列，每个位点均有4种可能选择，生物特有DNA条形码标签，仅仅15个位点就可产生415种选择[1]。由于有的位点碱基受选择压力不随环境的变化而改变，所以可以仅考虑蛋白质编码基因，根据密码子通用的性质，45个位点便可以形成10亿种不同序列。如今的DNA测序技术能够精准的检测一段几百bp长度的DNA序列，理论上，一段648 bp的DNA条形码足以鉴定所有物种。DNA条形码的原理是选择高度保守且在物种进化水平变异细微的DNA编码区或非编码区片段用以鉴定物种，但是找到这种通用标准序列片段比较困难[6]。目前COⅠ、16S rRNA、18S rDNA、Cytb、ITS、rbcSp为常用的几种通用片段[7-8]。

1.3 DNA条形码技术的发展现状

1.3.1COⅠ作为动物分类首选序列的优势

运用DNA条形码技术鉴定物种，首先需要一个标准序列用以和样本的序列进行比对。理想的DNA条形码序列需符合以下标准。1)序列的两端保守，能够设计用于扩增的通用引物。2)序列的变异速率适宜，既能够区别不同物种的生物，种内遗传变异又较小。线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ基因目前被普遍认同为标准的动物DNA条形码序列[9-10]，因其具有以下优势。1)mtCOⅠ基因5’末端约648 bp的序列保守，具引物扩增通用性[4]。2)该基因无内含子且严格遵循母系遗传，重组率低，拥有较高的拷贝数，从而将PCR扩增过程简单化[3]。3)mtCOⅠ序列具有较高的突变率，其碱基可能组合数远大于物种数。4)mtCOⅠ密码子第3位碱基的置换频率高，使其进化速率约是12 s DNA和16S DNA的3倍，具更多系统发育信息[6]。5)mtCOⅠ基因种间遗传距离基本小于1%，远小于种间遗传距离。Hebert在提出DNA条形码概念时，便运用COⅠ序列分析了动物界11门13 320个物种，其中可被明确鉴定的物种数占比高达98%[9]，可见使用mtCOⅠ基因作为标准序列的可行性。而目前COⅠ序列更是被广泛应用于鱼类、贝类、昆虫类等物种的鉴定[11-15]，发挥了极大的作用。

1.3.2 其他DNA条形码序列

高等植物的线粒体基因的进化速率十分缓慢，因此COⅠ序列并不能够作为植物的通用DNA条形码，通常使用cpDNA序列鉴定植物物种[8]。然而，研究结果显示，目前全世界高等植物约有30万种，且多倍体植物常见，又具有高种间杂交率，导致单基因组标记往往无法准确鉴别不同种植物。因此，第三届国际DNA条形码学术大会确定了将叶绿体rbcL与matK的基因组合作为植物DNA标准条形码，其对植物的鉴定率达到了72%[6]；同时将叶绿体trnH-psbA和ITS作为补充条形码[16]。但植物标准DNA条形码至今没有确定。菌类由于结构十分简单，仅形态鉴定几乎无法将其区分，其条形码研究主要运用rDNA或某些功能蛋白基因，如16S rDNA、ITS、微管蛋白基因等[5]。

1.3.3 DNA条形码技术的优势与挑战

对物种的准确鉴定是描述生物多样性的基础。传统物种鉴定基于对物种的形态观察与解剖，受物种生长发育的阶段与环境，以及鉴定者个人素质的影响。DNA条形码技术则可以弥补传统鉴定法的不足。相对于传统法来说，利用DNA条形码技术进行物种鉴定具有以下优势：1)由于物种生长时DNA序列并未发生变化，因此DNA条形码技术不受个体发育阶段和生长环境的影响，准确性较高；2)操作技术简单，通用性高，可实现一次性对大量样本的鉴定，对鉴定人员个人素质的要求不高；3)对样本要求低，DNA样本仅0.1 g便足以进行鉴定，且不需样本的高完整性，即使样本被降解也可用于鉴定，避免了鉴定人员的主观误差[17-19]；4)可将数据发送至BOLD数据库，从而实现资源的全球性共享。然而由于部分物种可能存在种内分化过高、种间分化不足的现象，种内与种间遗传距离可能重合，导致鉴定的不准确；同时，叶绿体与线粒体遵循单亲遗传，不利于鉴定杂交物种[20]；并且，一些新形成的物种差异可能非常小，能否运用DNA条形码技术鉴定这些物种仍存在争议。遗传学数据库的完备程度决定了DNA条形码技术鉴定物种的准确性[21]，然而，相对于庞大的生物物种数量来说，目前BOLD等数据库收录的DNA序列数目实在过于渺小，积极开发DNA序列是科研工作者们的必经之路。

2 DNA条形码技术在贝类分类中的应用

2.1 帘蛤目

帘蛤目属软体动物门、双壳纲。在我国，帘蛤目动物分布十分广泛且数目繁多，外形相似，依靠形态学方法将其分类的难度非常大。使用DNA条形码技术分类则使分类难度大大降低。王琳楠等[22]选取了帘蛤目16个物种110个个体进行研究，测得其COⅠ基因序列的种内平均遗传距离为0.010 6，虽然裂纹哥特蛤的遗传距离达到了0.018 2，但仍然在DNA条形码COⅠ基因种内遗传距离2%的界限内；种间平均遗传距离高达0.388 4，远大于种内遗传距离，完全符合作为DNA条形码基因序列所需满足的要求。将这些DNA条形码序列与BOLD中的已知序列对比，匹配率达100%。该研究的分类结果与形态学鉴定结果相同，验证了形态学鉴定的准确性。孟学平等[23]通过计算发现，长乐、漳州地区西施舌类群与其他地区的COⅠ基因种内遗传距离过大，从而证明了福建西施舌是西施舌的一个亚种。

2.2 珍珠贝亚目

珍珠贝亚目在双壳类软体动物中最具经济价值。冯艳微[24]对扇贝科的8个种63个个体的mtCOⅠ和16S rRNA的部分基因序列进行测序，结果表明mtCOⅠ种内遗传距离平均0.004 8，种间遗传距离平均0.284；16S RNA种内遗传距离平均0.001，种间遗传距离平均0.231；两者的种间遗传距离都远大于种内，存在明显的条形码间隙，能够有效鉴定扇贝科物种，但比较而言，COⅠ基因更适合作为珍珠贝亚目DNA条形码的标准基因。

2.3 贻贝目

贻贝目分布广泛，具有较高的食用价值。以往的形态学鉴定法往往根据其壳形、刻纹、闭壳肌痕等特征进行分类，难度较大。刘君采集了贻贝科3亚科、8属、11种共52个样品并扩增其COⅠ基因[25-26]，使用COⅠ的通用引物能够成功扩增10个种的基因，可见COⅠ引物有较高适用性；结果显示，除凸壳肌蛤外，COⅠ基因的种内遗传距离平均小于2%，种间遗传距离均在20%以上，最大可达60%左右，完全符合Hebert提出的10x规则[19]。且贻贝科COⅠ基因的种间遗传距离明显大于其他生物类群，可见COⅠ基因序列十分适合作为贻贝科的DNA条形码标准序列。研究同时表明，凸壳肌蛤之所以种内遗传距离过大，是因为存在线粒体双单亲遗传模式，父本线粒体的M和F类型都可能遗传给子代。因此试验时应尽量避免这种模式的干扰，首选提取贝类的闭壳肌组织。

2.4 其他贝类

除上述贝类之外，DNA条形码技术在鉴别其他贝类时同样被广泛地运用。刘君等[25]将DNA条形码技术应用于牡蛎科(Ostreidae)的48个样品，得到30条COⅠ序列和47条16S rDNA序列。经过研究表明COⅠ基因能较好分辨各个种，16S rDNA能较好的区分近缘种之外的大部分种类。经过遗传距离法分析证实，在牡蛎科中的巨牡蛎属(Crassostrea)为代表的一些种类，16S rDNA序列的遗传变异小于COⅠ序列。由此证明，COⅠ基因的使用效率大于16S rDNA。在对钉螺属(Oncomelania)的研究中， 徐玉梅等[27]选取安徽分别代表长江上、中、下游的3个地区水域所采集的钉螺，进行COⅠ基因分析，结果显示，3种不同水域钉螺种类的一致性达到98%及以上，表明基于COⅠ基因的DNA条形码技术在钉螺科应用的有效性[16]。

3 前景与展望

海洋贝类与人类息息相关，可供食用、药用或作为饵料，并且医学贝类种类繁多，是大量的对人体有害的吸虫或线虫的中间宿主。加快推动DNA条形码技术在海洋贝类分类与鉴定中的应用，合理正确地对海洋贝类进行分类，具有很大的医学价值。随着试验的不断深入，DNA条形码的数据库将逐渐被完善，检索也将会变得更加便捷高效。虽然DNA条形码的应用前景良好，但它的发展是建立在形态学的基础上的。因此，DNA条形码技术并不可能取代传统鉴定法而独立存在。我们在积极研究DNA条形码序列的同时，也应时刻注意与形态学的结合，如此才能够使DNA条形码技术达到更高的水平。