奶牛妊娠诊断技术现状及未来发展方向

杜超 ，刘深贺 ，程春宝，周子超 ，阮健 ，南良康 ，张淑君

（1.农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；3.湖北省畜禽育种中心，武汉 430070）

奶牛配种后，及时且准确的妊娠诊断对于牧场高效的繁殖管理十分重要。未妊娠奶牛若不能及时诊断出来，会延长空怀期，导致产犊间隔延长，繁殖效率降低，产奶量降低，进而造成经济损失等[1,2]。因此，配种后在尽可能短的时间内进行准确的妊娠诊断，在奶牛生产实践中具有重要意义。目前常用的奶牛妊娠诊断方法主要有直肠检测法、超声波检测法和妊娠相关物质检测法等。近年来，随着高通量技术的发展，转录组学、蛋白组学、代谢组学及中红外光谱（mid-infrared spectroscopy, MIRS）等新型技术也已应用于奶牛的妊娠诊断，且已经初步取得了一定的成果。

1 直肠检测法和超声波检测法

传统的奶牛妊娠诊断方法主要是直肠检查法和超声波诊断法等。通常情况下，这两种检测法相结合，称为经直肠超声波检测法。此外，也有经皮肤的超声波检测法。Hunnam等分别利用经直肠和经皮肤超声波技术对1 570头奶牛进行妊娠诊断，结果表明，在人工授精后31～155d，经直肠的准确率高于经皮肤法，在156～196d，二者的准确率无显著差异，几乎均可达到100%。由于经皮肤法简便，易于操作，因此，经直肠法适用于早中期妊娠诊断，而经皮肤法适用于中晚期妊娠诊断[3,4]。Gaja等利用超声波技术监测人工授精后牛黄体变化情况，结果发现，未妊娠牛在14～23d黄体逐渐退化；而妊娠牛在14～23d黄体维持在一定大小，不发生退化，且在18～23d妊娠牛黄体退化率显著低于未妊娠牛[5]。Gomez-Seco等表明，从人工授精后第19天开始，未妊娠牛的黄体开始退化，而妊娠牛的黄体体积保持在一定大小，且在20～22d，妊娠牛黄体体积显著大于未妊娠牛[6]。Scully等利用超声波技术研究表明，在人工授精后7～18d，妊娠牛与未妊娠牛的黄体回声特征及子宫回声特征无明显差异，黄体的面积及黄体的血流面积也无明显差异，然而，在16～18d妊娠牛的黄体血流量比（黄体血流面积与黄体面积的比值）显著高于未妊娠牛[7]。

由此可见，利用经直肠超声波技术，通过监测黄体的退化情况、面积大小或者其他特征，可对奶牛进行妊娠诊断。但这两种诊断法操作过程繁琐，易对牛产生侵入性伤害，同时对操作人员的技术要求比较高，若操作不当，容易造成胚胎死亡[8]。

2 妊娠相关物质诊断法

妊娠期间，由于生殖器官分泌水平的改变或者早期孕体的特异性表达，会导致母体血液、乳汁中的部分妊娠相关物质，如孕酮、妊娠相关糖蛋白（pregnancy associated glycoproteins, PAGs）等的含量发生改变，这种改变可被用作妊娠诊断。

2.1 孕酮

孕酮主要是由卵巢上的黄体分泌。奶牛配种后，未妊娠牛由于黄体的退化，孕酮含量较低，而妊娠牛因黄体持续存在，孕酮含量可维持在较高水平。Gaja等研究表明，未妊娠牛在人工授精后第16天开始，血液中孕酮含量急剧下降，妊娠牛则可维持在一定水平，在18～23d，妊娠牛显著高于非妊娠牛[5]。Scully等得出同样的研究结果[7]。Gomez-Seco等研究表明，从人工授精后第18天开始，未妊娠牛血液中孕酮含量持续下降，妊娠牛则维持在一定水平，18～22d妊娠牛显著高于未妊娠牛[6]。此外，Xu等研究表明，妊娠牛乳汁中孕酮含量均大于7ng/mL，而非妊娠牛则低于3ng/mL[9]。

2.2 妊娠相关糖蛋白（PAGs）

妊娠相关糖蛋白（PAGs）是哺乳动物妊娠期间，由胎盘滋养层细胞合成并分泌的一类糖蛋白，其中，妊娠特异性蛋白B（PSPB）是最早被鉴定的妊娠相关糖蛋白家族成员。Friedrich等研究表明，奶牛配种后，未妊娠牛血液中PAGs含量维持在较低水平，妊娠牛在约22d开始其含量逐渐升高，25～35d，妊娠牛含量显著高于未妊娠牛[10]。Gajewski等研究表明，奶样中PAGs含量的变化趋势与血样中一致，即未妊娠牛一直维持在较低水平，而妊娠牛从配种后第28天开始逐渐升高[11]。

通过检测妊娠相关物质的含量进行妊娠诊断，具有简单、快速等优点。然而，这种方法一般在配种后四周左右才能获得可靠结果，其灵敏度、特异性、阳性预测值以及阴性预测值等指标一般均可达到90%以上[11,12～20]。而在配种后的第一个情期内（21d），利用上述四个指标无法获得可靠的结果。因为奶牛的发情周期是21d，这就会导致授精后未妊娠奶牛错过配种时期，从而增加生产成本。此外，妊娠相关物质的检测方法主要是放射免疫法（RIA）和酶联免疫法（ELISA）等。然而，这两种方法对检测仪器设备要求比较高，费用昂贵，尤其是RIA法，需要使用专门的放射性同位素，若操作不当，会造成放射性同位素的浪费甚至会有辐射的危害[9]。

3 新型技术在奶牛妊娠诊断中的应用

近年来，随着高通量技术的逐渐成熟，一些新型技术，如转录组学技术、蛋白组学技术、代谢组学技术以及中红外光谱技术（mid-infrared spectroscopy,MIRS）等已应用于奶牛的妊娠诊断。这些新型技术已取得了一定的成果，组学技术已初步鉴定到一些妊娠相关生物标志物，如基因、miRNA、氨基酸以及蛋白质等，MIRS技术已初步鉴定出若干妊娠奶样与未妊娠奶样的差异光谱区域或应用于奶牛妊娠诊断判别模型的建立等。

3.1 组学技术鉴定的妊娠相关生物标志物

3.1.1 基因

Mayer等研究表明，人工授精后第20天，妊娠奶牛血液中art2a和bovb基因的表达量显著高于未妊娠奶牛，尤其是bovb基因灵敏度以及特异性达到83%和75%[21]。Sakumoto等采集人工授精后14～18d的奶牛血样，通过qRT-PCR研究表明，妊娠CCL8和CXCL10基因的表达量呈现上升趋势，且在第18天时显著升高，而非妊娠牛的表达量无变化。由此可见，通过检测这些基因的表达量变化有助于早期妊娠诊断[22]。Yoshino等研究表明，人工授精后20～22d，妊娠奶牛血样中ISG15和MX2基因的表达显著高于未妊娠奶牛，诊断准确率可达到80%[23]。

3.1.2 miRNAs

Ioannidis等采集发情后第0、8和16天未妊娠奶牛的血样以及配种后第24天妊娠奶牛的血样，通过miRNA测序以及qPCR验证的方法，发现16个差异表达的miRNA，此外，妊娠牛miR-26a的表达显著高于未妊娠牛，因此miR-26a可以作为早期妊娠诊断的潜在的生物标志物[24]。随后，为了扩大妊娠诊断的范围，Ioannidis等对发情当天和配种后第60天妊娠奶牛的血样进行miRNA测序，结果共发现77个差异表达的miRNA，且miRNA-26a在发情当天、配种后第8、16和60天妊娠牛血样中的表达量呈现上升趋势，且在配种后第8天妊娠牛血样中的表达量就显著高于发情当天，进一步表明miRNA-26a在奶牛早期妊娠阶段可能发挥着重要的作用[25]。Schanzenbach等采集发情后第4、12、18天奶样以及配种后第4、12、18天妊娠牛的奶样，通过miRNA测序方法共发现25个差异表达的miRNA[26]。Markkandan等在未妊娠牛和配种后第30天妊娠牛的血样中共检测出29个差异表达的miRNA[27]。

3.1.3 氨基酸和蛋白质

Han等采集未妊娠牛的奶样和人工授精后第35天妊娠牛的奶样，利用蛋白质组学分析技术，发现39个差异表达蛋白。进一步通过蛋白质免疫印迹验证实验将lactoferrin以及alpha-1G确定为早期妊娠诊断的生物标志物[2]。GUO等以10头奶牛为研究对象，经同期发情处理后，采集发情当天和人工授精后第17天乳样（10头奶牛后期均被确定为成功妊娠），采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-Q/TOF-MS）代谢组学技术，筛选两组乳样的代谢差异物，最终将L-酪氨酸、N-乙酰基-L-酪氨酸、L-脯氨酸、四氢1-苯甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉、鸟苷和十七烷基肉碱确定为妊娠识别阶段的潜在乳样生物标志物[28]。Johnston等利用LC-MS/MS技术对奶牛发情当天与人工授精后第21天乳样进行研究，结果发现APOB、SPADH1、PLIN2和LPO在乳清中差异表达，PIGR、PGD、QSOX1、MUC1、SRPRA、MD2、GAPDH、FOLR1、GPRC5B和HHIPL2，在富含细胞外囊泡的乳清中差异表达，这些蛋白质可能成为潜在的妊娠诊断生物标志物[29]。

3.2 中红外光谱技术在奶牛妊娠诊断中的应用

中红外光谱（mid-infrared spectroscopy, MIRS）技术是基于特定区域中特定波长的各种化学基团的振动，用于定性或者定量检测物质的一种技术[30]。作为一种新型现代分析检测技术，MIRS技术具有无损、快速、高通量和低成本等优点，已被广泛应用于牛奶的大规模检测[31]。目前，MIRS技术主要是预测牛奶中营养成分的含量，如脂肪酸、矿物元素或者蛋白质等的含量[31]，以及判断牛奶是否掺假或者是否有抗生素残留[32～34]等，在奶牛妊娠诊断中的研究尚不多。Lainé等研究表明，妊娠对中红外光谱968～1 577cm-1区域的影响最大[35]。Toledo-Alvarado等研究表明，利用脂肪、蛋白质、酪蛋白、乳糖、胎次以及泌乳天数等作为预测因子，采用一般线性模型预测奶牛是否妊娠时，将MIRS数据也作为预测因子加入到预测模型中，会提高预测模型的准确率[36]。这些研究为今后MIRS技术在奶牛妊娠诊断中的应用奠定了一定的基础。

4 展望

及时准确的妊娠诊断对提高奶牛场的管理效率和养殖经济效益具有重要的意义。目前，虽然已建立了多种奶牛妊娠诊断方法，如直肠检测法、超声波诊断法以及妊娠相关物质诊断法等，然而随着奶牛养殖规模化和集约化程度的不断提高，这些妊娠诊断方法越来越难以满足现代奶牛养殖需求。因此，开发简便、快速的奶牛妊娠诊断技术十分必要。今后，可利用组学等新型技术继续筛选妊娠相关生物标志物，通过生物信息学分析，寻找与妊娠相关的关键基因或者蛋白，并结合功能验证实验阐明关键基因或者蛋白的作用机制，进而应用于奶牛的妊娠诊断。此外，也可在现有 MIRS技术在奶牛妊娠诊断研究的基础上，尝试利用MIRS数据建立妊娠诊断判别模型，进而快速（甚至是在配后的第一个情期内）准确地判断奶牛的妊娠状况，进一步提高奶牛的繁殖管理效率。