超高效液相色谱串联质谱法同时检测蜂蜜中多种抗生素残留的研究

2019-01-08徐宜宏李晓东姜玲玲

畜牧与饲料科学 2018年12期

徐宜宏，李晓东，姜玲玲，张彤，钟钰

（中华人民共和国沈阳海关，辽宁沈阳 110016）

蜂蜜中含有丰富的果糖和葡萄糖，是大脑神经元所需要的主要能量元素，它能很快被人体吸收利用，不仅能够改善人体的血液循环、补充营养、缓解和恢复人体疲劳，还能起到润肺止咳、消积通便等作用[1-2]，因此，随着人们生活水平逐渐提高，蜂蜜的消费需求正在逐年增大。然而，在蜜蜂养殖过程中，蜂群极易感染美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病、麻痹病等疾病，不可避免地会使用到喹诺酮类、四环素类、磺胺类等抗生素，导致蜂蜜中抗生素残留问题严重，消费者通过食用蜂蜜，间接将这些抗生素摄入到身体中，从而导致体内抗生素大量残留，影响身体健康，因此，建立一种能够快速、准确测定蜂蜜中多种药物残留的方法势在必行。

目前抗生素残留检测的方法主要有加速溶剂萃取法[3]、液相色谱法[4-5]、液相色谱串联质谱法[6-9]等，该文根据国内外限量要求，建立了蜂蜜中四环素类、大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类、硝基咪唑类等5类24种常用兽药基于QuEChERS[10-12]技术提取净化的超高效液相色谱串联质谱的定性和定量方法。经实验证明该方法准确、灵敏度高、重现性好，能够满足同时检测蜂蜜中多种抗生素残留的需要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂：甲醇、乙腈均为色谱纯；甲酸、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠、醋酸钠均为分析纯；C18吸附剂购于天津Bonna-Agela公司。

1.1.2 仪器设备：Acquity UPLC/QTRAP 5500液相色谱串联质谱仪，沃特世公司/AB SCIEX公司；X1R低温离心机，Thermo公司；Vortex-Genie 2涡旋振荡器，Scientific Industries公司；BSA822电子天平，Sartorius公司；CPA225D电子天平，Sartorius公司；N-EVAP111氮吹仪，Organomation Associates公司；Milli-Q Gradient超纯水机，Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理：称取2.0 g样品于50 mL塑料离心管内，加入10 mL含1.0%（V/V）甲酸的乙腈溶液和0.1 g Na2EDTA，振荡1 min；再加入4.0 g无水硫酸钠和1.0 g氯化钠，涡旋混匀15 s，超声15 min，9 000 r/min离心5 min；将6 mL上清液加入900 mg无水硫酸钠，150 mg C18吸附剂，水平振荡5 min，使吸附剂和提取液充分接触；以9 000 r/min离心5 min，静置10 min沉淀蛋白后，取3 mL上清液于10 mL试管中，40℃下氮气浓缩至干。加入1 mL 0.1%甲酸—乙腈（9∶1）的定容液，涡旋混匀后，过0.22 μm滤膜，供超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS／MS）测定。

1.2.2 色谱与质谱条件的选择

1.2.2.1 液相色谱条件的选择：色谱柱为AC-QUITY UPLCTMBEH C18（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm）；柱温：40℃；样品室温度：室温；进样体积：10 μL；流速：0.2 mL/min；流动相 A：甲醇；流动相 B：0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱条件见表1。

表1 24种抗生素梯度洗脱条件

1.2.2.2 质谱条件的选择：选择ESI+为检测离子源，离子源温度为550℃；离子喷雾电压及入口电压分别为5 500 V和10 V；雾化气压力、辅助加热气压力、气帘气压力分别为345、345、207 kPa；用MRM扫描模式。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择优化

传统QuEChERS方法常用的提取液为乙腈，但考虑到蜂产品中含有大量的糖分、水分、酶类，同时查阅文献分析，设计乙腈、1.0%（V/V）甲酸—乙腈溶液、Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸3种提取液进行实验比较。每类待测物选取1～2个代表性药物测定回收率，结果见表2和图1。

由结果可知，仅使用乙腈为提取溶剂时，四环素类抗生素的回收率较低，这可能与该类物质易与蜂蜜中钙、镁、钠等矿物质离子螯合形成难溶的盐类有关。使用加入Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作为提取液时，抑制此类化合物与阳离子的螯合，回收率较高，因此，初步选用Na2EDTA的酸性乙腈（含1%甲酸）作为提取液。

表2 提取溶剂种类对回收率的影响 %

图1 提取溶剂种类对回收率的影响

2.2 质谱条件的优化

经过反复试验，得出24种抗生素的最优质谱条件。各抗生素的检测离子见表3。多反应监测色谱图见图2。

3 方法学验证

3.1 回收率及精密度

在空白蜂蜜中添加不同含量水平的多种抗生素混标，制成模拟加标样品，按上述试验方法操作，同时做空白对照。所得到的样品中各待测抗生素的添加回收率和相对标准偏差见表4。

试验结果表明，在所考察的蜂蜜中，24种抗生素的回收率在68.0%～104.0%，相对标准偏差为3.2%～15.5%，待测抗生素都能得到较理想的回收率，该方法符合检测方法对精密度的要求。

3.2 线性关系和检出限

用空白样品溶液稀释混合标准储备溶液，制备成不同浓度的混合标准工作溶液，在选定色谱和质谱条件下，用混合标准工作溶液分别进样，以峰面积（y）为纵坐标，以工作溶液的浓度为横坐标，绘制6点标准工作曲线。标准工作曲线、线性回归方程及相关系数r见表5。向空白样品中添加不同质量的标准溶液，按上述方法进行测定，24种抗生素的检出限均可达到1 μg/kg。

4 结论

该文对应用超高效液相色谱串联质谱法同时检测蜂蜜中喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类等多种抗生素残留进行了系统研究，以1%甲酸乙腈—Na2EDTA溶液为提取液，液相色谱串联质谱仪同时对蜂蜜中多种抗生素进行检测。该方法具有操作简单、试剂使用量小、检测周期短等特点，且最低检测限完全满足目前的市场要求，可在实际检测样品时节约大量人力、物力及时间成本。