苦参素对肝纤维化大鼠肝脏转化生长因子-β1的调节作用

金学琴，黎伟华，李志梅，何生存，潘 琳

（1.宁夏医科大学实验动物中心，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004；4.宁夏医科大学总医院检验科，宁夏 银川 750004）

苦参素（oxymatrine，OMT）又名氧化苦参碱，是一种喹嗪类生物碱，从传统中药广豆根中提取所得[1]，其药理作用包括调节免疫反应、抗炎症、抗过敏反应和抑制组胺释放[2]。OMT（C15H24N2O2）作为有效的单体生物碱临床已用于治疗慢性病毒性肝炎[3-4]，它能够显著降低体内血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的水平，对临床症状有所改善。有文献报道其通过激活Nrf2/HO-1和调节炎性TLR4信号通路对肝衰竭起到保护作用[5]，但其具体作用机制尚未明确。该试验通过探讨 OMT 对转化生长因子-β1（TGF-β1）通路的影响，进一步了解OMT抗肝纤维化的作用机制，为临床治疗肝纤维化用药提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物：60只雄性SD大鼠（SPF级），体重 （250±50）g，由宁夏医科大学实验动物中心[SCXK（宁）2015-0001]提供，并饲养于宁夏医科大学实验动物中心屏障内[SCXK （宁）2015-0001]，室温、昼夜（12 h/12 h）明暗交替饲养，自由进水摄食。 每只动物仅用于一个单一的试验并按动物实验“3R”原则给予人道关怀。

1.1.2 主要试剂与设备：氧化苦参碱（OMT）由中国食品药品检定研究院提供，在使用前用生理盐水配制成所需浓度；水飞蓟素胶囊由德国马博士大药厂提供；硫代乙酰胺 （TAA）和谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、谷胱甘肽（GSH）各试剂盒由中国南京建成试剂公司提供；TGF-β1检测试剂盒由中国上海森雄科技实业有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组与处理：将60只SD大鼠随机平均分为6组，分别为阴性对照组、模型组和OMT高、中、低剂量给药组以及水飞蓟素阳性对照组。使用硫代乙酰胺（200 mg/kg）对OMT高、中、低剂量给药组和模型组、水飞蓟素阳性对照组大鼠进行腹腔注射，每周3次，连续2周；第3周开始每周2次，连续6周；第9周开始每周1次，连续4周。在造模的第2周开始至造模结束，对阴性对照组及模型组大鼠给予生理盐水灌胃；对OMT高、中、低剂量给药组大鼠分别给予苦参素（80、40、20 mg/kg）灌胃；对水飞蓟素阳性对照组大鼠给予水飞蓟素（30 mg/kg）灌胃，每天1次。至第12周末，处死大鼠并采血留取血清，迅速取其肝组织超低温保存。

1.2.2 血清中ALT、AST和GSH指标的测定：将大鼠麻醉后取血，将取得血液室温静置1 h，3 000 r/min离心15 min，分离上层血清。按试剂盒操作说明书采用酶标法检测血清中ALT、AST和GSH的含量。

1.2.3 肝组织匀浆中TGF-β1含量的测定：按试剂盒操作说明书采用酶标法测定肝组织匀浆中TGF-β1含量。

1.3 数据处理

用SPSS 11.5统计分析软件对数据进行单因素方差分析和t检验，计量数据以±S表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 OMT对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型大鼠血清中ALT、AST和GSH的影响

与阴性对照组相比，模型组大鼠血清转氨酶ALT和AST含量极显著升高（P<0.01）。与模型组相比，OMT高、中、低剂量给药组及水飞蓟素阳性对照组大鼠血清转氨酶ALT和AST含量均显著（P<0.05）降低。与阴性对照组相比，模型组大鼠血清GSH含量极显著（P<0.01）下降。与模型组相比，水飞蓟素阳性对照组大鼠肝组织GSH表达量显著上调 （P<0.05）；OMT高剂量和中剂量给药组GSH含量极显著（P<0.01）升高，而低剂量给药组GSH含量显著（P<0.05）升高，结果见表1。

表1 OMT对肝纤维化大鼠血清ALT、AST和GSH的影响

表2 OMT对肝纤维化大鼠肝组织匀浆中TGF-β1含量的影响

2.2 OMT对硫代乙酰胺诱导的肝纤维化模型大鼠肝组织匀浆中TGF-β1含量的影响

阴性对照组大鼠肝组织TGF-β1表达量很少。与阴性对照组相比，模型组大鼠肝组织TGF-β1含量极显著（P<0.01）升高。与模型组相比，OMT高、中、低剂量给药组大鼠肝组织中TGF-β1含量显著（P<0.05）下降（见表 2）。

3 讨论

慢性肝病进展成肝硬化必须要经历肝纤维化阶段，它是影响慢性肝病预后的重要环节[6-7]。研究肝损害和肝纤维化最常用的模型是用硫代乙酰胺诱导大鼠肝损伤。其机制为硫代乙酰胺能造成大鼠肝细胞膜的脂质破坏和蛋白变性，细胞膜受损，细胞内酶外漏，血清ALT和AST活性增高[8]。 ALT、AST 含量越高，提示肝纤维化及肝硬化的程度越重。Saleh等[9]研究结果表明，二氢吲哚衍生物能够显著降低急性小鼠肝损伤模型中小鼠血清ALT和AST含量。该研究中，与阴性对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST水平极显著升高，表明模型组大鼠肝损伤形成。与模型组比较，OMT高、中、低剂量给药组大鼠血清ALT和AST含量显著降低，表明OMT高、中、低剂量给药组能减轻肝损伤，改善肝脏功能，延缓肝纤维化的形成。

GSH为抗氧化系统成员之一，是一种自由基清除剂，可以屏蔽各种过氧化物的毒性作用，在氧化应激期间，GSH 的水平受到影响[10]，因此，GSH作为肝损伤的检测补充指标，其活性也可以特异性地代表肝损伤情况。Younis[11]等报告了CCl4诱导的肝组织损伤大鼠血清ALT、AST含量显著升高，GSH 含量显著降低。Wang 等[12]研究表明，没食子酰基金丝桃酐可显著升高氧化应激诱导的肝损伤大鼠血清GSH含量。该研究中，OMT高、中、低剂量给药组能够显著升高被降低的肝纤维化大鼠血清GSH含量，并呈剂量依赖性。硫代乙酰胺（TAA）诱导的大鼠肝纤维化模型中，肝细胞在清除产生的毒性自由基时消耗了较多的GSH[10]。模型组大鼠血清GSH含量显著降低。当给予不同剂量苦参素干预时，大鼠血清GSH含量显著上升，并呈剂量依赖性。这是因为，苦参素对肝损伤有保护作用，可以延缓肝纤维化，给予20 mg/kg OMT时毒性自由基减少，肝脏中的GSH消耗的量减少，从而使GSH的含量升高。而随着OMT剂量增加到40～80 mg/kg时，GSH含量的升高远远超过了阴性对照组，该现象可能与OMT剂量过高引起的毒性反应有关[13]。该试验在给予40 mg/kg和80 mg/kg剂量苦参素所测得的GSH含量高于阴性对照组，出现该现象的具体原因还有待于深入研究。

TGF-β1表达的差异参与了肝纤维化从发生到发展整个过程[14-15]，说明体内肝纤维化程度与肝组织中TGF-β1表达的高低有密切关系。张英博等[8]研究表明，在CCl4诱导的小鼠肝纤维化中，肝脏TGF-β1水平显著增加，给予补阳还五汤治疗40 d后的小鼠肝组织中TGF-β1水平显著下降。李秧秧等[16]研究结果表明，糖尿病大鼠非酒精性脂肪型肝病纤维化模型中，与阴性对照组相比，模型组TGF-β1水平显著增加，当给予棉酚治疗4～8周后，大鼠肝脏组织中TGF-β1水平显著下降，病理检查肝纤维化程度明显减轻。在该试验中，阴性对照组大鼠肝组织表达TGF-β1的量极少，模型组大鼠肝组织TGF-β1的含量明显高于阴性对照组（P<0.01），OMT高、中、低剂量给药组大鼠肝组织中TGF-β1的表达被显著下调 （P<0.05）。TGF-β1对肝纤维化的调节作用可能是通过细胞内信号转导通路发挥作用的，其与肝纤维化的发生、发展密切相关，是肝纤维化发生的主要信号传导途径[8，16-18]。

该研究表明，OMT可明显降低肝纤维化模型大鼠肝脏组织中TGF-β1的基因表达，这个结果提示OMT抑制肝纤维化的机制之一可能是对TGF-β1表达的抑制。而苦参素对肝纤维化大鼠中TGF-β1下游因子如smads家族蛋白的调节作用，以及苦参素对肝纤维化大鼠细胞内有关肝纤维化信号通路的影响，有待于进一步的研究。