适应活化条件对起泡葡萄酒酵母发酵特性的影响

2019-01-08马腾臻鲁榕榕孙永蓉李梦捷杨学山韩舜愈

农产品加工 2018年24期

马腾臻，鲁榕榕，孙永蓉，温靖，李梦捷，杨学山，韩舜愈

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，甘肃兰州 730070）

瓶内二次发酵是生产优质起泡葡萄酒的传统方法，然而接种时较低的发酵温度、碳源和可同化氮源含量，较高的酒精度、总酸和游离SO2含量，以及发酵过程中所产生的CO2压力和一些有毒副产物（如C6-C12中链脂肪酸和有机酸）等严重影响了起泡葡萄酒的二次启酵及发酵进程[1-2]。

适应活化是指酵母菌对一个或多个抑制因子几小时或几天的适应过程[3]。此过程中，酵母激活了与高酒精浓度及其他抑制条件相关的新陈代谢应激反应，并在较大程度上减弱了抑制因子对酵母细胞的影响[4-5]。研究表明，酵母复水活化过程中稀释倍数、活化液含糖量、活化温度和时间[6-8]等对提高酵母菌活性具有重要作用。为避免酿造过程中酵母细胞大量死亡而导致的发酵提前终止，酿酒师们往往在接种前用酒水混合液对商品活性干酵母进行适应性活化处理，近年来商品氮源和酵母活化剂等在酿酒工业中日也益受到重视[9-10]。

碳源是酵母生长及维持生命活动的最基本物质，发酵液中的糖含量能够改变酵母细胞在适应活化阶段的生长及代谢过程，从而影响后续发酵进程[11]。氮源是酵母生长代谢所需的重要营养元素，活化基质中氮源的类型（有机氮或无机氮）及含量能够提高酵母菌生物量、细胞活力及其在严苛环境下的生长生存能力[12]，从而影响二次发酵过程和产品品质[13]。

适应活化过程中，氧气可参与酵母细胞内不饱和脂肪酸和甾醇类物质的合成，从而提高酵母生物量及其乙醇耐受性，从而促进二次发酵[14-15]。研究表明，少量通气可使酒精发酵过程中酵母活细胞数增加[16]，但过多氧气的存在则可能导致酵母细胞中活性氧（ROS）的积累[17]。

由于起泡葡萄酒的二次发酵需在原酒中进行，因此对起泡葡萄酒酵母发酵性能进行评价时，除考虑酿造静止葡萄酒时的起酵速度、发酵活力、酒精耐受性、抗二氧化硫能力和不良风味物质的产生等指标外，还需考虑其自溶能力、产气能力、耐压能力、低温发酵能力等特殊指标[18-19]。

试验以常用于起泡葡萄酒酿造的EC1118酵母为材料，研究了适应活化过程中不同碳源、氮源含量和通氧条件对模拟葡萄酒发酵过程中酵母生物量、产气能力、自溶性、絮凝性和耐受性的影响，以期为瓶内二次发酵过程中酵母菌的适应性活化及起泡葡萄酒的生产提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

酿酒酵母EC1118，法国Lallemand公司提供；牛血清蛋白，SIGMA-ALDRICH（上海）贸易有限公司提供；考马斯亮蓝、蔗糖、磷酸氢二铵、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、甘油、醋酸钠、氢氧化钾、乙醇、偏重亚硫酸钠等试剂，天津市光复精细化工研究所提供。

1.2 仪器设备

Genesis 10s型紫外-可见分光光度计，美国Thermo Scientific公司产品；10713型起泡酒压力测定仪，意大利ZAMBELLI公司产品；SPX-300-II型生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司产品；CP 214型电子分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司产品；18100型摩尔超纯水机，重庆摩尔水处理设备有限公司产品；EX31型生物显微镜，舜宇光学科技有限公司产品；NRY-2102型恒温空气摇床，上海南荣实验室设备有限公司产品；H2050R型台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母活化

（1）适应活化[20]。①复水。按推荐用量将酵母EC1118用10倍体积的蒸馏水（38℃）活化30 min；②扩培。将步骤①所得菌悬液接入模拟酒中扩培24 h（25℃，150 r/min）。模拟酒配方。蔗糖质量浓度45 g/L，酒石酸质量浓度4 g/L，柠檬酸质量浓度0.5 g/L，苹果酸质量浓度1.5 g/L，磷酸氢二铵质量浓度100 mg/L，甘油质量浓度4 g/L，乙醇体积分数8%（V/V），醋酸钠质量浓度0.134 g/L，并用氢氧化钾溶液调节pH值为3.1。③适应性活化。将步骤②所得菌悬液接入乙醇含量为10%的模拟酒中培养48 h（模拟酒碳源、氮源含量及通氧条件如表1所示）。

（2）普通活化。将复水活化的酵母菌悬液接入乙醇含量为10%的模拟酒中继续活化30 min，记为对照（CK）组。

适应活化时的培养条件见表1。

表1 适应活化时的培养条件

1.3.2 生物量测定

用血球计数法对酵母菌细胞计数，每个样品重复测定3次，并按公式（1）计算[21]：

酵母细胞数=

1.3.3 酵母发酵特性测定

（1）模拟酒配方。调整蔗糖含量为20 g/L，不添加乙醇和磷酸氢二铵，其余成分同1.3.1中扩培阶段模拟酒。

（2）产气能力。按5×106CFU/mL接种量向装有模拟酒（乙醇体积分数为10%（V/V））的艾氏发酵管中接种经不同方式活化的酵母菌，于28℃下静置培养24 h，测定产气量（mL）[18]。

（3）酵母的自溶性。参照王玉霞方法，以活化上清液中的蛋白质含量评价酵母自溶性[18]。

蛋白质含量标准曲线见图1。

图1 蛋白质含量标准曲线

（4）酵母的絮凝性。取2 mL酵母活化培养液，蒸馏水稀释10倍，充分摇匀后于波长620 nm处测定吸光度并记为N1，静置30 min后测定吸光度并记为N2，絮凝系数为N2/N1[18]。

（5）乙醇耐受性。调整模拟酒中的乙醇体积分数分别为10%，11%，12%（V/V），接种酵母并于28℃条件下静置培养24 h，测定产气体积[18]。

（6） SO2耐受性。调整模拟酒中的SO2质量浓度分别为50，75，100 mg/L，接种酵母并于28℃条件下静置培养24 h，测定产气体积[18]。

（7）高酸耐受性。配置pH值为3.0，3.2，3.5的模拟酒，接种酵母并于28℃条件下静置培养24 h，测定产气体积[18]。

（8）低温耐受性。向乙醇体积分数10%（V/V），pH值3.1，SO250 mg/L的模拟酒中接种酵母，于12，16℃条件下静置培养48 h，记录产气体积[18]。

1.4 数据处理

用SPSS Statistics 19.0进行试验数据的差异显著性分析（Duncan法，多因素方差分析，p＜0.05）。

发酵特性标准化处理[1]：

2 结果与分析

2.1 不同适应活化条件对酵母菌生物量的影响

不同适应活化条件下酵母菌生物量见图2。

图2 不同适应活化条件下酵母菌生物量

由图2可知，酵母生物量受氧气条件、碳源和氮源含量的综合影响，经适应活化方式培养的酵母菌生物量高于普通活化方式所得酵母，尤其是有氧条件处理组，生物量差异更为显著（p＜0.05），且高于厌氧条件处理组，这可能与酵母细胞进行有氧呼吸代谢，处于生长增殖状态有关。就碳源含量而言，中等质量浓度条件（22 g/L）活化处理所得酵母菌的生物量较高；就氮源含量而言，厌氧条件活化时随氮源含量的升高，酵母菌生物量也随之增大，而有氧条件时则呈先增大后降低的趋势，这可能与活化培养基碳氮比及通氧条件共同作用有关。

2.2 不同适应活化条件对酵母菌产气能力的影响

不同适应活化条件下酵母菌产气能力见图3。

由图3可知，不同适应活化条件对酵母菌产气能力有较大影响，随活化基质中碳源和氮源含量的增加，酵母菌的产气量基本呈上升趋势。尽管有氧呼吸时CO2的产量远高于厌氧条件下，但厌氧条件活化所得酵母菌在随后的发酵试验中展现了远高于有氧条件活化菌株的产气能力，这可能是由于厌氧条件下，某些参与TCA循环的酶仍然保持活性，这些额外的代谢途径能够合成细胞功能所需的重要前体物质，并决定最终产气体积[22]。

图3 不同适应活化条件下酵母菌产气能力

2.3 不同适应活化条件对酵母菌絮凝性的影响

不同适应活化条件下酵母菌絮凝指数见图4。

图4 不同适应活化条件下酵母菌絮凝指数

由图4可知，厌氧条件活化所得酵母菌株的絮凝性明显优于有氧条件活化所得菌株，且差异显著（p＜0.05），而与普通活化处理相比差异不显著。有氧条件活化所得酵母菌株的絮凝性随碳源含量的增高而增大（N3除外），但氮源含量的改变对所得菌株的絮凝性影响不显著。此外，当活化培养基中氮源含量较低时（50 mg/L），不同通氧条件所对应的酵母絮凝指数随碳源含量的增大呈相反变化趋势，这可能与活化时的不同呼吸方式有关。

2.4 不同适应活化条件对酵母菌自溶性的影响

不同适应活化条件下酵母菌自溶性评价见图5。

图5 不同适应活化条件下酵母菌自溶性评价

由图5可知，厌氧条件活化所得酵母菌株的自溶性比有氧条件活化所得菌株较高，但与普通活化处理相比，除NOS3N2和NOS2N3外，其余处理组差异不显著。酵母自溶过程中释放的甘露糖蛋白等胶体类物质，可提高酒样中蛋白质和酒石酸的稳定性，并与芳香化合物相互作用，提升葡萄酒酒体的饱满度。选择蛋白质合成能力强，发酵结束后能迅速自溶的酵母菌对提升起泡葡萄酒品质具有重要作用[22]。

2.5 不同适应活化条件对酵母菌高酸耐受性的影响

二次发酵时，较低的发酵温度，基酒中较高的初始乙醇体积分数、总酸及游离SO2含量等限制性因素均会抑制酵母菌的生长繁殖和发酵进程[19]。适应活化过程中，通氧条件及培养液中的碳源和氮源含量可使酵母菌完成从生殖生长到发酵代谢过程的转化[11-12]，提升其对抗性环境的耐受性，是促进二次发酵顺利完成的重要辅助措施。

不同适应活化条件下酵母菌的高酸耐受性见图6。

图6 不同适应活化条件下酵母菌的高酸耐受性

由图6可知，厌氧环境活化所得酵母菌在不同pH值模拟葡萄酒中的产气量显著高于有氧条件活化和普通活化组所得酵母（pH值3.0时NOS1处理组除外），从总体趋势上看，随活化培养基中碳源和氮源含量的升高，酵母菌在模拟葡萄酒发酵时的产气量也随之升高，但较低pH值条件下的产气量高于中等pH值条件（白葡萄酒中pH值3.0和pH值3.2属于较低条件，pH值3.5则属于中等条件）。葡萄汁和葡萄酒中的pH值对酵母菌的生长至关重要，不仅决定其生长及发酵速率，对具有感官特征的重要代谢产物也有影响[22]。尽管酿酒酵母的生长速率和发酵速率随会pH值降低而减缓，但对于适应活化后的酵母，其在pH值3.5的模拟酒中可能更多地进行了生殖生长，而在较低pH值条件下则主要进行酒精发酵，因此导致了产气量的不同，但还需进一步测定发酵后的生物量进行确认。

2.6 不同适应活化条件对酵母菌的乙醇耐受性影响

研究表明，酵母菌通过膜通透性的破坏和流动性的变化实现对乙醇毒性的适应性响应，膜的完整性依赖于存活因子（甾醇和长链不饱和脂肪酸）的补充，含有高浓度存活因子的酵母细胞具有很强的迅速完成发酵的能力，这也是适应性活化的主要作用[11]。

不同适应活化条件下酵母菌的乙醇耐受性见图7。

图7 不同适应活化条件下酵母菌的乙醇耐受性

由图7可知，随模拟葡萄酒中乙醇体积分数的升高，酵母细胞通过补充细胞膜上的存活因子进行响应，这种补充在一定程度上抵消了乙醇的破坏作用，部分恢复了细胞膜原有的通透性和流动性，但发酵过程中的二氧化碳产量依然呈降低趋势。尽管普通活化处理所得菌株对乙醇的耐受力优于大多数适应活化处理所得酵母，但随乙醇体积分数的增加（从10%～12%），NOS2，NOS3和OS3适应活化处理酵母也逐渐显露出其对乙醇体积分数的耐受能力。此外，随活化培养基中碳源含量（仅在厌氧环境条件下）和氮源含量的增加，酵母对乙醇的耐受性增强，尤其是厌氧活化处理组更为明显。

DAMORE等学者也指出，细胞膜流动性的变化是决定酵母细胞耐受性的主要因素，氧气在甾醇和长链不饱和脂肪酸等物质的合成中具有重要作用，是影响酵母菌乙醇耐受性的主要因素，同时酵母菌对高温和高酒精度的耐受性相似，可通过应激反应减少对细胞活性的影响。

2.7 不同适应活化条件对酵母菌的SO2耐受性影响

不同适应活化条件下酵母菌的SO2耐受性见图8。

图8 不同适应活化条件下酵母菌的SO2耐受性

由图8可知，酵母菌在模拟酒中的产气量随SO2质量浓度升高而降低，其中有氧环境活化所得酵母对SO2的耐受性显著高于厌氧环境活化所得酵母，但后者与普通方式活化所得酵母相比差异不显著。此外，有氧条件时，随活化培养液中碳源含量和氮源含量的增加，活化酵母菌对SO2的耐受性也随之提高，部分处理组差异显著。

研究表明，酵母可利用SO2或SO42-等硫元素合成含硫氨基酸和其他代谢产物，但分子态SO2则又通过多种形式抑制微生物的生长，如提高胞内浓度，使蛋白质中的二硫键断裂或与NAD+和FAD中的辅因子起反应等[22]。此外，抑制酵母菌生长所需的分子态SO2质量浓度受葡萄酒pH值、温度、微生物数量与种类、生长期、酒精度等因素的共同影响，最适含量还需进一步确定。

2.8 不同适应活化条件对酵母低温耐受性的影响

不同活化条件下酵母菌低温耐受性见图9。

图9 不同活化条件下酵母菌低温耐受性

对于起泡葡萄酒而言，为保留更多的香气和CO2，常选择在较低的温度下进行二次发酵。如图9所示，与普通活化方式相比，适应活化显著提升了发酵过程中酵母菌对低温的耐受能力（OS1处理组除外），厌氧环境活化所得酵母菌在随后发酵过程中的产气量高于有氧环境活化所得酵母菌，且差异显著，此外产气量也随活化培养基中碳源和氮源含量的升高而升高。

2.9 酵母菌最佳活化条件的确定

考虑到活化过程所涉及的指标变化及对酵母菌发酵性能的评价参数较多，很难确定较佳的适应活化条件，对相关数据的标准化处理是解决该难题的有效方法（计算方法见1.4）。

不同活化条件下酵母菌发酵特性OI总值见表2。

表2 不同活化条件下酵母菌发酵特性OI总值

表2为不同活化条件下酵母菌发酵特性标准化处理值之和（即OI总值），大多高于普通活化所得OI总值（5.82），表明发酵前适应活化处理可提高酿酒酵母菌的发酵特性。

衡量酵母菌发酵特性的OI总值随活化培养基中碳源和氮源含量的升高而升高，且在不同通氧活化条件下表现出不同的发酵特性，这可能是由于对相近环境的更快适应所致，NOS3N2处理条件活化所得酵母的OI值最高，最适合于起泡葡萄酒的二次发酵，即酵母EC1118的最佳适应活化条件为厌氧培养，活化培养基中蔗糖质量浓度30 g/L、磷酸氢二铵质量浓度100 mg/L。