记忆性ILCs研究进展①

王宪伟 田志刚

(合肥微尺度物质科学国家研究中心分子医学部，中国科学技术大学免疫学研究所,合肥230027)

固有淋巴细胞(Innate lymphoid cells，ILCs)是近年来新发现的一类淋巴细胞，由NK细胞、ILC1s、ILC2s、ILC3s、淋巴组织诱导细胞(Lymphoid tissue-inducer cells,LTi)和ILCregs细胞组成[1-4]。由于缺少Rag蛋白介导的重排机制，ILCs细胞无法表达多样性的、抗原特异性的识别受体，因此ILCs属于固有免疫细胞。ILCs细胞亚群在发育和功能上，与T细胞亚群一一对应。在抵抗病原体和肿瘤的免疫应答早期发挥不可替代的作用。NK细胞分泌颗粒酶、IFN-γ等，能够抗病毒、抗肿瘤。ILC1s能够分泌IFN-γ和TNF-α，应答病毒和细菌感染[5,6]。ILC2s分泌IL-4、IL-5和IL-13,抵抗寄生虫感染，或促进过敏原诱导的Ⅱ型炎症反应[7,8]。ILC3s通过产生IL-17A和IL-22，抵抗胞外菌感染，并修复受损的肠道上皮[9,10]。LTi细胞可以产生淋巴毒素β，从而诱导淋巴结的形成[11]。ILCregs分泌IL-10和TGF-β，负调促炎性ILCs亚群，维持组织稳态[12]。与T细胞不同，ILCs无需预先致敏，即可迅速反应。因而传统上，我们认为ILCs具有固有免疫细胞的属性。

免疫记忆是适应性免疫细胞的特征之一。初次致敏诱导抗原特异性T、B细胞活化，并获得免疫记忆功能。当机体再次遭遇相同的抗原刺激时，记忆性T、B细胞表现出更强烈、更迅速的免疫应答。2006年，von Andrian研究组发现，不仅仅是T、B细胞，NK细胞也能够介导抗原特异性接触性超敏反应，这是首次提出“记忆性NK细胞”的概念[13]。随后，Lanier和Yokoyama研究组分别在鼠巨细胞病毒(Murine cytomegalovirus，MCMV)感染模型和细胞因子诱导模型中独立地证明了记忆性NK细胞的存在[14,15]。到目前为止，记忆性NK细胞已被广泛报道存在于猴、人等高等动物的病毒感染等多种疾病中[16-19]。有趣的是，最新的研究揭示了ILC1s和ILC2s细胞同样也具有免疫记忆功能[20,21]。半抗原致敏的淋巴结和肝脏IL-7Rα+ILC1s能够介导长期的过敏性皮炎反应[21]；ILC2s则对细胞因子IL-33等刺激产生免疫记忆，促进肺脏过敏性炎症的进程[20]。我们认为，这些新的发现赋予了ILCs适应性免疫细胞的属性，拓展了ILCs细胞的研究范畴。本文将讨论记忆性ILCs细胞的研究进展，建立记忆性ILCs研究体系，重新认识ILCs在疾病进程中的作用。

1 记忆性NK细胞

1.1半抗原诱导记忆性NK细胞 半抗原诱导的接触性超敏反应是模拟人类接触性皮炎的经典动物模型，通常认为是由T细胞介导的炎性反应。然而，von Andrian研究组报道，在T、B细胞缺陷的Rag2-/-鼠中，CHS(Contact hypersensitivity)反应仍能发生；而在T、B、NK细胞均缺陷的Rag2-/-γc-/-鼠中，CHS反应无法被诱导[13]。这些证据充分证明了NK细胞能够介导T、B细胞非依赖的抗原特异性免疫记忆反应，“记忆性NK细胞”的概念由此提出[13]。通过过继转输实验发现，肝脏NK细胞能够获得免疫记忆功能；而脾脏NK细胞无此功能，说明半抗原诱导的记忆性NK细胞具有“肝脏限制性”[13]。他们的后续研究发现，流感病毒、HSV、HIV免疫过的小鼠中，肝脏NK细胞能够保护小鼠更好地抵抗第二次病毒感染；此外，趋化因子受体CXCR6在记忆性NK细胞的稳态维持中发挥重要作用[22]。记忆性NK细胞“肝脏限制性”谜题直到2013年才被揭开。我们发现肝脏NK细胞是一个异质性群体，由CD49a+肝脏驻留NK细胞(Liver-resident NK cells,LrNK)和CD49b+传统NK细胞(conventional NK cells,cNK)组成，LrNK细胞不参与血液循环[23-25]。LrNK细胞高表达CXCR6，能够获得对半抗原的免疫记忆潜能，从而介导接触性皮炎反应[23]。因其组织驻留特性，这群具有免疫记忆功能的NK细胞仅存在于肝脏中[23]。另有研究报道Ahr-/-鼠中，CD49a+LrNK细胞显著减少，来源于Ahr-/-鼠的LrNK细胞不能将免疫记忆传递给受者鼠，揭示了AhR对于LrNK细胞发育及免疫记忆功能的重要性[26]。

CD49b+cNK细胞也被报道能够介导CHS反应。半抗原前体莫诺苯宗(Monobenzone)诱导的CHS反应主要由CD49b+cNK细胞介导[27]。皮肤黑色素细胞将莫诺苯宗代谢成为半抗原，进而以炎性小体依赖的方式激活巨噬细胞，分泌IL-18，从而活化CD49b+cNK细胞，并使其获得对半抗原的免疫记忆功能[27]。记忆性CD49b+cNK细胞能够特异性杀伤黑色素细胞，控制B16.F10黑色素瘤的生长[27]。最近的研究表明，Ly49分子完全缺陷可导致NK细胞无法介导CHS反应；敲入Ly49C/I使Ly49-/-鼠重新获得对半抗原的免疫记忆，这表明接受过“教育”的NK细胞具有记忆潜能[28]。进一步研究发现，Ly49C/I能够与特定序列肽段相互作用，促进NK细胞介导的记忆反应，这表明半抗原可能与Ly49C/I敏感性肽段形成复合物，进而活化NK细胞[28]。然而，这些发现意味着抗原特异性是由体内Ly49C/I敏感性自身肽段决定的，无法解释NK细胞如何区分不同的半抗原。抗原识别问题依然是肝脏记忆性NK细胞领域面临的主要问题。此外，Ly49C/I仅表达于循环的CD49b+cNK；而且CD49b+cNK缺少CXCR6的表达，未知的因子可能参与了记忆性CD49b+cNK的肝脏限制性形成。因此，我们认为在半抗原诱导的记忆性NK细胞体系中，可能存在CD49a+CXCR6+LrNK细胞和CD49b+Ly49C/I+cNK细胞分别介导的两种机制。

1.2MCMV病毒诱导小鼠记忆性NK细胞 2009年，Lanier研究组首次在病毒感染模型中证明了记忆性NK细胞的存在[14]。MCMV病毒感染后0～7 d，NK细胞活化，开始克隆扩增；7～14 d，效应性NK细胞发生细胞凋亡，数量减少；存活的NK细胞最终进入稳定的免疫记忆阶段，其动力学过程与CD8+T细胞类似[14]。

NK细胞的完全活化需要3个信号：①抗原识别信号Ly49H、Ly49D等；②共刺激信号CD226分子；③Ⅰ型干扰素、IL-12等促炎性信号[29]。NK细胞表面的活化性受体Ly49H，能够识别MCMV病毒组分m157蛋白，并激活下游的DAP12接头分子[14,29]。活化性受体Ly49D，一方面能够促进Ly49H+NK细胞获得免疫记忆[30]；另一方面，也能够直接识别MHCⅠ类分子H-2Dd，在小鼠骨髓移植模型中应答同种异基因的供者细胞，形成记忆性Ly49D+NK细胞[31]。Ly49H+NK细胞表面的共刺激分子CD226能够结合DC(Dendritic cell)细胞表达的CD155和CD112分子，向下游Fyn和PKCη传递信号，活化NK细胞[32]。促炎性因子Ⅰ型干扰素、IL-12、IL-18、IL-33等均被报道能通过多种机制促进记忆性Ly49H+NK细胞的形成[33-36]。IL-12刺激可以促进转录因子STAT4和Zbtb32的表达[35,37]。STAT4结合Runx1和Runx3基因的启动子区，进而促进二者的表达；Runx1进而调控Ly49H+NK细胞的细胞周期，促进其细胞增殖[38]。Zbtb32则可以通过抑制转录因子Blimp-1表达，促进Ly49H+NK细胞的活化[37]。另一个炎性因子IFN-α，能够促进STAT1、STAT2和IRF9的表达[39]。最近的研究表明，STAT1、STAT2或IRF9缺陷的小鼠中，Ly49H+NK细胞活化扩增以及细胞存活能力显著降低，这些结果揭示了Ⅰ型干扰素对于记忆性Ly49H+NK细胞形成及维持的重要作用[39]。

在Lanier研究组建立的过继转输模型中，MCMV病毒感染的第7天，供者Ly49H+NK细胞可扩增1 000倍，达到效应峰值[14]；随后，效应性Ly49H+NK细胞以Bim分子依赖的方式进入凋亡期[40]。少量效应Ly49H+NK细胞依赖BNIP3和BNIP3L介导的自噬相关机制，清除受损的线粒体，降低胞内ROS水平，从而抵抗细胞凋亡[41]。与半抗原诱导的“肝脏限制性”记忆NK细胞不同，记忆性Ly49H+NK细胞能够在脾脏、肝脏等多种淋巴组织和非淋巴组织中长期维持，该过程受到IL-15的调控[42]。尽管记忆性Ly49H+NK细胞的形成过程描述的较为详尽，但效应性NK细胞转化为记忆细胞的机制仍然不清楚。最新的研究表明，转化的过程可能受到表观遗传的调控。与初始或效应NK细胞相比，记忆性NK细胞的ISRE元件基因的染色质开放程度更高；而TCF-LEF、NF-κB等通路相关基因的开放程度较低[43]。NK细胞记忆开关的分子调控机制仍需进一步的研究。

记忆性Ly49H+NK细胞与CD8+T细胞有很多共同的特征。它们都经历了克隆扩增、细胞凋亡、免疫记忆等阶段，二者免疫应答时相是一致的[14]。其活化都需要抗原识别分子、共刺激分子、促炎性分子三条信号，且这些信号均由DC细胞提供[29]。免疫记忆形成过程中，NK细胞和CD8+T细胞共用部分关键调控因子，比如Bim促进效应细胞凋亡，BNIP3介导的自噬帮助效应细胞抵抗凋亡，以及IL-15维持记忆细胞存活等。免疫细胞代谢是近年来活跃的研究领域，记忆性NK细胞和T细胞在代谢上也有共同之处。效应性T细胞倾向于使用葡萄糖作为能量，代谢方式以有氧糖酵解为主；而记忆性T细胞的脂肪酸氧化水平更高，这种代谢方式有利于记忆性细胞的长期存活[44,45]。代谢同样能够调控NK细胞的功能和存活能力[46]。与人初始NK细胞相比，记忆性NKG2C+NK细胞表现出更高的有氧糖酵解和氧化磷酸化水平[47]。ARID5B介导的代谢重编程对于记忆性NK细胞的形成和维持起到关键作用[47]。

1.3HCMV病毒诱导人记忆性NK细胞 除小鼠外，记忆性NK细胞在病毒感染的猴、人等高等动物中也是存在的。NK细胞先天缺陷的人极易受到HCMV病毒的威胁，其中NKG2C+NK细胞亚群是控制HCMV感染的关键因素。有研究表明，器官移植的患者中，潜伏的HCMV病毒出现再活化，选择性地诱导NKG2C+NK细胞扩增，这些扩增的NK细胞能够持续存活一年以上[18]。鉴于上述特性，人NKG2C+NK细胞被认为是记忆样NK细胞。此外，在汉坦病毒、HCV等病毒感染的人群中也发现了这种记忆样NKG2C+NK细胞[17,48]。后续的研究表明，这些患者均存在HCMV的共感染，因此HCMV是驱动人记忆样NK细胞的主要因素[17,48]。有研究应用RNA流式细胞术在CMV和SIV感染的猴子中也确定了病毒感染诱导的记忆性NKG2C+NK细胞的存在[49]。

人NKG2C+NK细胞如何识别HCMV病毒一直是困扰这一领域的难题。最新的研究表明，被HCMV感染的细胞能够通过MHCⅠ类分子HLA-E将HCMV病毒组分UL-40蛋白递呈给NK细胞表面的NKG2C/CD94复合物，这就提供了NK细胞活化所需的抗原识别信号[50]。与小鼠记忆性Ly49H+NK细胞类似，人NKG2C+NK细胞的完全活化仍需IL-12等促炎性信号的协助[51]。人NKG2C+NK细胞中，FcRγ阴性的亚群表现出对HCMV病毒更强的免疫应答，该过程是抗体依赖的[19]。HCMV感染可以活化FcRγ阴性细胞中的CD3ζ-Zap70信号通路，并且PLZF、HELIOS等基因启动子区出现甲基化[19]。此外，人记忆样NKG2C+NK细胞IFNG基因表现出持续的染色质开放状态，这意味着当机体再次遭遇HCMV感染或HCMV再活化时，人NKG2C+NK细胞能够更迅速的产生IFN-γ，以达到控制病毒的目的[52]。

1.4细胞因子诱导泛特异性记忆NK细胞 2009年，Yokoyama研究组首次在没有特定抗原的条件下诱导出了记忆性NK细胞[15]。细胞因子IL-12/15/18联合刺激可使小鼠cNK细胞获得免疫记忆潜能；当再次用IL-12等细胞因子刺激时，cNK细胞分泌IFN-γ的能力进一步增强，这种类型的免疫记忆被称为泛特异性记忆NK细胞[15]。细胞因子诱导的记忆性NK细胞具有长寿命特征，能够存活至少12周[53]。机制上，细胞因子刺激诱导小鼠cNK细胞Ifng基因呈现持续的去甲基化状态，这种长期的免疫印迹导致cNK细胞能够更强烈地响应细胞因子刺激[54]。并且，这种表观遗传修饰能够传递给NK细胞的子细胞，这意味着记忆性NK细胞分裂产生的细胞即使不经历细胞因子/抗原刺激也能获得免疫记忆功能[53,54]。此外，人CD56bright和CD56dimNK细胞均能被细胞因子IL-12/15/18诱导获得免疫记忆样功能[55]。

细胞因子诱导的记忆性NK细胞具有以下特性：①强烈的二次应答；②长期存活能力；③无需特定抗原。基于上述优势，多项研究已将细胞因子诱导的记忆性NK细胞用于肿瘤免疫治疗。对小鼠cNK细胞用IL-12/15/18预刺激，并联合化疗可显著抑制RMA-S肿瘤细胞的生长[56]。更重要的是，在一项Ⅰ期临床实验中，细胞因子诱导的人记忆性NK细胞被应用于AML患者治疗，结果显示44%的患者病情得到完全缓解，这表明记忆性NK细胞可能是肿瘤免疫治疗的新策略[57]。

1.5其他类型记忆性NK细胞 记忆性NK细胞在自然界是广泛存在的。SIV病毒免疫过的恒河猴能够特异性的杀伤荷载Gag和Env蛋白的DC细胞，表明猴NK细胞具有免疫记忆功能[16]。小鼠肝脏CXCR6+NK细胞能够对流感病毒、HIV、HSV等产生免疫记忆，保护机体抵抗第二次致死性感染[22]。后续研究表明高表达CXCR6的肝脏CD49a+LrNK细胞亚群是应答流感病毒感染，并获得免疫记忆功能的主要细胞群体[58]。此外，人CD56dimNK细胞能够对流感病毒产生记忆，这种记忆性NK细胞表现出NKp46内化的特征[59]。这些研究为基于记忆性NK细胞的新型疫苗策略的研究和应用提供了理论基础。

2 记忆性ILC1s

传统上，ILC1s被定义为能够分泌IFN-γ和TNF，且不具备杀伤功能的辅助性ILCs细胞亚群[1-5]。ILC1s与NK细胞共同构成抵抗病毒感染的第一道固有免疫防线，ILC1s甚至比NK细胞更早启动免疫应答[6]。然而，最近的一项研究表明ILC1s也能够介导半抗原诱导的免疫记忆反应，这赋予了其适应性免疫细胞的属性[21]。胸腺和淋巴结中存在一群特殊的IL-7Rα+NK细胞，这群细胞发育上不依赖骨髓来源的NK前体细胞[60,61]。自ILCs概念出现后，这群IL-7Rα+NK细胞已被划分为ILC1s细胞[1]。有趣的是，半抗原皮肤致敏可诱导IL-7Rα+ILC1s向引流淋巴结迁移，该过程依赖趋化因子受体CXCR3[21]。IL-7Rα+ILC1s进入淋巴结后，能够应答半抗原，并分泌大量的IFN-γ和TNF，处于功能活化状态[21]。致敏48 h，IL-7Rα+ILC1s免疫应答达到峰值；72 h，IL-7Rα+ILC1s获得免疫记忆功能，并迁出引流淋巴结[21]。记忆性ILC1s依赖CXCR6选择性地长期驻留在肝脏，其稳态维持依赖肝脏中的IL-7分子[21]。肝窦内皮细胞可以产生CXCL16[62]，而肝实质细胞则能产生IL-7[63,64]，因此肝窦是一个富含CXCL16和IL-7的独特微环境，为记忆性IL-7Rα+ILC1s在肝脏中的长期驻留和存活提供了物质基础。这项研究揭示了淋巴结-肝脏轴对于记忆性IL-7Rα+ILC1s的形成及长期维持具有重要意义。

接触性皮炎是生活中常见的过敏性皮肤病，通常认为T细胞在其中起关键作用。然而在小鼠CHS模型中，NK细胞及IL-7Rα+ILC1s均被证明能够介导半抗原诱导的皮炎反应，这暗示人NK细胞或ILC1s可能也有类似的作用。一项针对ACD(Allergic contact dermatitis)患者的研究表明，CD56brightNK细胞在炎性皮肤部位大量聚集，这群NK细胞高表达CXCR3，与小鼠记忆性IL-7Rα+ILC1s表型一致[65]。然而，在体外实验中，来源于ACD患者的NK细胞无法对过敏原金属镍离子二次应答，这可能是由于人NK细胞不能直接识别镍离子[65]。因此，体内模型如人源化小鼠，可能是研究人类记忆性NK细胞或ILC1s的理想体系。

记忆性ILC1s与T细胞既有共同特征，也有区别之处。二者具有类似的迁移模式，记忆性T细胞遵循淋巴结-骨髓轴，而记忆性ILC1s则依赖淋巴结-肝脏轴。IL-7对于记忆性T细胞和ILC1s的维持都起到至关重要的作用。IL-15是NK细胞和ILC1s发育的核心调控因子，且记忆性NK细胞和T细胞的存活均依赖IL-15，是否记忆性ILC1s也需要IL-15尚不清楚。二者的区别之处在于免疫应答的动力学和识别机制，ILC1s在应答72 h后即获得免疫记忆功能，远早于T细胞；T细胞依赖特定TCR识别抗原，而ILC1s如何识别多种抗原尚不清楚。

3 其他记忆性ILCs亚群

ILC2s被定义为：功能上分泌IL-4、IL-5和IL-13,发育上依赖转录因子GATA3和Rorα的ILCs亚群[1-4,7,8]。ILC2s在过敏原、寄生虫等导致的Ⅱ型免疫应答中发挥重要作用。最新的研究揭示了ILC2s具有适应性免疫应答的特征——免疫记忆[20,66]。过敏原致敏可以诱导肺脏ILC2s迅速扩增、活化[20]。由于ILC2s无法直接识别过敏原，肺上皮细胞产生的IL-33是ILC2s激活的关键因素。随后，ILC2s获得对IL-33的免疫记忆潜能，IL-33再刺激可诱导记忆性ILC2s的二次应答，使其分泌更高水平的IL-5和IL-13，促进肺脏炎症的发生[20]。此外，记忆性ILC2s能够更好地促进Th2细胞分化，从而启动适应性免疫应答[20]。尽管肠道ILC2s高表达IL-25R，肺脏初始ILC2s中IL-25R表达处于较低水平[20]。然而，当肺脏ILC2s进入免疫记忆状态后，IL-25R的表达显著上调[20]。因此，IL-25R可能是肺脏记忆性ILC2s的分子标志。此外，IL-33也能诱导淋巴结ILC2s的活化，是否淋巴结ILC2s也具有免疫记忆功能尚不清楚[20]。考虑到淋巴结-肝脏轴对于记忆性ILC1s的重要意义，可能类似的迁移模式同样存在于记忆性ILC2s体系中，这值得进一步深入的研究。记忆性ILC2s的发现具有重要价值，它促使我们以适应性免疫的角度重新思考ILC2s在哮喘等易复发的慢性炎症中的作用。到目前为止，是否ILCs其他亚群，包括ILC3s、LTi细胞和ILCregs等具有免疫记忆功能尚不清楚。

4 结语

近十年来，ILCs发育和固有免疫功能的研究日趋成熟，已形成包括NK细胞、ILC1s、ILC2s、ILC3s、LTi细胞和ILCregs等家族成员构成的完整体系。然而，ILCs的适应性免疫属性的研究仍较薄弱。现已有证据表明，多种ILCs细胞能够对抗原或细胞因子刺激产生免疫记忆，包括对半抗原、MCMV病毒、细胞因子IL-12/15/18记忆的NK细胞，对半抗原记忆的ILC1s，对IL-33记忆的ILC2s。目前是否ILC3s及其他ILCs亚群也具有免疫记忆功能尚不清楚。此外，尽管小鼠中存在记忆性ILC1s和ILC2s，是否人类也具有类似的亚群仍需深入的研究。ILCs细胞不具有Rag蛋白介导的多样性受体表达，它们如何识别多种半抗原、病毒抗原等仍是这一领域面临的最大挑战。记忆性ILCs的发现，不仅是对ILCs基础生物学认识的突破，更具有广泛的应用价值。记忆性NK细胞在预防免疫及肿瘤免疫治疗中已展现巨大的价值，记忆性ILCs的研究进展将继续推动其在人类疾病治疗中的应用。