牛乳中硝基呋喃代谢物检测技术研究进展

朱宁，赵艳坤，蔡建星，安静，陈贺

（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业部农产品质量安全风险评估实验室（乌鲁木齐）/新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐 830091）

硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基基本结构的广谱抗菌药物，由于其强毒性和致癌性，已引起世界各国的高度重视，我国农业部规定动物源性食品中呋喃唑酮的限量为不得检出[1]。硝基呋喃类药物被用于小牛体内，治疗痢疾等肠道疾病。与此同时，若奶牛食用含有硝基呋喃成分的饲料添加剂，则不可避免地造成牛乳中硝基呋喃代谢物的残留，给牛奶带来严重的质量安全隐患[2]。

常见的硝基呋喃类药物有4种，即呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮。呋喃类物质在动物体内稳定性较差，能迅速分解，其代谢产物分别为3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基乙内酰脲（AHD）和5-甲基吗啉代-3-氨基-2-唑烷酮（AMOZ），可以与组织蛋白结合形成稳定的化合物，残留时间长达数周之久。这些代谢物在弱酸性条件下可从蛋白质中释放出来( 如人类胃液的酸性条件)，因此当人类食用了含有硝基呋喃类抗生素残留的食品后，其在胃液里释放出来被人体吸收，对人类健康造成危害[3]。通用的牛乳加工方法难以使蛋白结合态硝基呋喃残留物降解，长期食用含有此类物质的牛奶，会打乱体内菌群平衡[2]，严重的会产生溶血性贫血、血小板减少性紫癜和多发性神经炎等[4]，因此了解、归纳牛奶中硝基呋喃代谢物的检测原理、检测技术并用于指导实践，对牛奶质量安全具有重要意义。

本文主要介绍牛奶中硝基呋喃代谢产物检测技术及发展趋势，包括前处理方法、仪器测定方法。

1 样品前处理

由于硝基呋喃代谢物在酸性条件下才能从蛋白质中释放出来，因此通用的样品前处理方法是先使样品在酸性条件下水解，再加试剂使其衍生化，经过提取、净化等步骤，最后上仪器测定[5]。

1.1 样品衍生化

1.1.1 什么是样品衍生化

衍生化是为了增加分子质量，使化合物不在高噪音背景下，增加特征碎片离子的选择性，提高质谱响应。硝基呋喃代谢物衍生化一般在37℃过夜进行，亲核基团R-NH在酸性催化环境会很快游离出来与2-NBA碳酰基发生化学作用[6]，增加代谢物的离子化效率，水解后生成硝基苯衍生物。衍生试剂大多选择2-硝基苯甲醛(2-NBA)，也可以选择2，4-二硝基苯甲醛、2-羟基-5-硝基苯甲醛[7]。

1.1.2 硝基呋喃代谢物衍生化的必要性

(1) 从硝基呋喃结构看，其代谢物极性相对较强， 它们的结构易和色谱柱硅胶表面重金属发生螯合形成“二次保留”，造成死吸附、降低感度、峰形展宽拖尾、与相关杂质及基质的分离度不佳，严重影响结果判断[8]。

(2) 从液相色谱仪利用的紫外-可见检测器分析看，硝基呋喃结构的紫外光谱吸收不明显，灵敏度过低[8]，经衍生化后紫外吸收加强，使其检测限可以达到1.0μg/kg。

(3) 从质谱检测分析看，硝基呋喃类代谢物的相对分子量较小、离子化效率低、 离子碎片无特征性， 直接进行质谱测定时会造成较大困难。对硝基呋喃类药物的代谢物进行衍生有利于质谱检测时离子碎片的选择[8]。

蒙君丽等人在研究分析中，使牛奶样品与2-硝基苯甲醛进行反应，对硝基呋喃类代谢物进行衍生化，加入0.5mol/L三氯乙酸5mL，加入0.05mol/L衍生化试剂2-硝基苯甲醛（二甲亚砜溶解）0.2mL，37℃衍生化16h[3]，结果使目标化合物的离子化达到最佳水平，试验中各化合物都得到了较好的色谱峰形。

测定牛奶中硝基呋喃类药物代谢物时，样品基质蛋白、脂肪等干扰物质较多，影响最终的定性定量结果。所以，硝基呋喃代谢物经衍生化后，需要进一步的提取和净化，才可用于检测，得到准确的检测结果。

1.2 硝基呋喃代谢物的提取净化

硝基呋喃类代谢物属于兽药成分的一类。针对兽药残留检测，常用的提取净化方法有液液萃取法、固相萃取法、凝胶渗透色谱、免疫亲和色谱、超临界流体萃取、分子印迹等[9]。现在最常用的方法为液液萃取法和固相提取法。

1.2.1 液液萃取法

在硝基呋喃代谢物提取净化过程中，几种硝基呋喃类抗生素及其代谢物可能同时残留在介质中，衍生后的特性和溶解性不同，利用其组分在溶剂中的不同溶解度可达到分离提取的目的[7]。液液萃取净化方法简单，并且可以大大缩短净化时间，但是提取物范围较广泛，特别是对于牛奶这种基质复杂的样品，会造成共提出物质较多。Freitas 等[10]与 Storey 等[11]建立的方法利用液液萃取却有不错的回收率，可以满足几十种兽药残留同时定量检验的要求。样品溶液的pH对萃取效率有很大的影响，丁涛等[12]试验不同pH值对回收率的影响，发现pH值为7～7.5时，AHD、AOZ、SEM和AMOZ代谢物的衍生产物提取效率最高。

1.2.2 固相萃取法

固相萃取是在液液萃取的基础上建立的一种净化方法，填料为一般硅胶键合固定相，基于固体填料与样品中的目标化合物产生各种作用力，将目标物与样品基质分离，再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取分离效率高，处理样品的容量大，使用有机溶剂少。蒙君丽等采用Oasis HLB固相萃取柱，用5mL甲醇、5mL水活化，再使样品备用液全部过柱[3]，取得较好的效果。

由于牛奶样品中的高蛋白、高脂肪，采用液液萃取较容易产生乳化现象，需要加入去乳步骤，从而延长了试验操作时间。根据分离模式不同，相对于液液萃取，固相萃取具有高效、快速、重现性好、净化效果佳、少用有毒有害溶剂、环保、经济的优点。商品化的固相萃取小柱也越来越多样化。对于牛奶中硝基呋喃代谢物的检测，固相萃取方法更为适合。

2 样品的仪器检测方法

2.1 高效液相色谱法( HPLC)

高效液相色谱法是最早被采用的硝基呋喃类药物检测方法。高效液相色谱大多用于硝基呋喃原药化合物的检测。该法的优点是自动化、精确度高，假阳性率低，缺点是仪器昂贵、操作繁琐、样品处理复杂、成本高、废弃试剂易造成环境污染，并需要专业分析人员。

通常采用高效液相色谱结合紫外检测器测定硝基呋喃类药物代谢物，在检测中由于呋喃结构的紫外光谱吸收不明显，导致灵敏度过低，经衍生化试剂衍生化后，可产生强紫外吸收，但是复杂的基质还会导致测定困难和干扰。用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)检测硝基呋喃代谢物，已有对4种硝基呋喃类药物同时检测的方法，但由于样品基质复杂，会对实验结果造成干扰，所以在前处理过程中必须严格按照要求净化。此方法过程较繁琐、复杂，需要花费大量的时间和试剂，同时在应用中也有一定的局限。该方法若要在硝基呋喃类药物残留检测中广泛应用还需要不断的改进。Angelini等[13]利用LC-UV方法检测牛肌肉组织中4种硝基呋喃类药物的残留，方法的检测限是1mg/kg，定量限是2mg/kg，平均回收率76%。

2.2 高效液相色谱配合质谱技术(LC-MS)

近些年来，高效液相色谱配合质谱技术(LC-MS)在硝基呋喃代谢物残留的检测中越来越多地被采用，相信也可以被引入到牛乳测定中。目前，色谱技术广泛应用于多组分混合物的分离和分析，质谱仪可对单一组分提供高灵敏度和特征的质谱图，质谱检测器具有稳定性好、定量准确、抗干扰能力强、检测限低、测定快速等特点[1]。LC-MS 是一种灵敏度高、选择性好、特异性强、可快速分析确证硝基呋喃类药物残留的方法。但是缺点同高效液相色谱法一样，仪器设备的购置和运行费用较高，检测过程中涉及大量的有机溶剂，对环境污染较大，周期也比较长[14]，距成为常规分析方法尚有一定距离。荷兰瓦郝尼罕RIKIL T-DLO实验室建立了完整的LC-MS法用于检测呋喃唑酮代谢物 AOZ 及其他代谢物[15]。

由于牛乳中几种硝基呋喃类抗生素及其代谢物可能同时残留，所以与LC-UV相比，LC-MS更适合牛乳中硝基呋喃代谢物的检测。

2.3 高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)

高效液相色谱-串联质谱法是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在色谱部分对试样中的各个组分进行分离，在质谱检测器入口被离子化，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图[7]。HPLC-MS/MS 也被广泛应用于测定各种复杂基质样品中的硝基呋喃类代谢物，该方法在对被测化合物的定量上有更高的可信度，同时具有相对较高的灵敏度，比液相色谱法的灵敏度高10倍以上，还具有更高的选择性和精密度，对于假阳性问题，HPLCMS/MS 法可以利用待测分子的结构来定性，排除酶联免疫方法和高效液相色谱法检测的假阳性结果，用以确证检测结果。欧盟目前认为 HPLC-MS 只能用于对硝基呋喃代谢产物进行筛选实验，对检出的阳性结果必须再用 HPLC-MS/MS 进行确证[16]。余建新等[17]采用微量化样品前处理技术，以邻硝基苯甲醛为衍生剂和电喷雾正离子多反应监测方式，建立了蜂蜜及水产品中4种硝基呋喃类抗生素代谢物残留量同时测定的液相色谱一串联质谱联方法。方法的检出限为0.02～0.3ng/g，线性范围均＞102，线性方程的相关系数r＞0.997，回收率79.0%～95.6%。柳毅[5]用高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中硝基呋喃代谢物，得到呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物、呋喃妥因代谢物和呋喃唑酮代谢物的检测限均为0.50μg/kg；在0.50～10.0μg/kg添加浓度的回收率均≥70%；相对标准偏差RSD≤15%。

2.4 化学发光免疫法（酶联免疫法，ELISA）

化学发光是当基态分子吸收化学反应中释放的能量跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回到基态时产生的光。基于化学发光强度和被测物含量之间关系建立的分析方法叫化学发光分析法[18]。在此基础上，将化学发光与免疫分析方法相结合，得到诸多发光免疫分析研究成果。发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术，该技术不但具有超过放射免疫的高灵敏度，而且具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，且测试中不使用有害的试剂，试剂保存期长，稳定性好，检测范围宽，可实现在不需要衍生的情况下直接测定其代谢物，从而大大减少了时间和成本。缺点是经常会出现假阳性结果，抗干扰能力相对较弱。国内外关于硝基呋喃类抗生素免疫分析方法的报道很少。现有文献报道的ELISA方法优点是灵敏度高、操作简便、检测迅速[7]，但不能作为确认方法，同时由于ELISA方法特异性较强，故仅能对单一组分进行检测，无法同时一次性检测样品中的呋喃唑酮及AOZ、呋喃它酮及AMOZ、硝基呋喃妥因及AHD、硝基西林及 SEM。Chang等[19]采用ELISA测定可食性动物组织中呋喃唑酮代谢物时以苯甲醛作为衍生化试剂，生成苯AOZ的衍生物进行检测，回收率为55.8%～99.6%。

目前国外已有检测呋喃唑酮、呋喃它酮代谢物的商品化试剂盒开发出来。我国谢世红等[20]建立了用四合一免疫胶体金快速检测试剂板同时快速检测水产品中残留的4种硝基呋喃类代谢物残留的方法。结果表明，该方法检测速度快、时间短，准确率高；最低检出限为AOZ 1.0μg/kg、SEM 1.0μg/kg、AMOZ 2.0μg/kg、AHD 2.0μg/kg；假阳性率小于5%，假阴性率为0；对实际样品的检测结果与仪器方法一致。若运用于牛乳中估计会有显著的效果。

3 我国的现有标准

3.1 关于高效液相色谱

农业部1077号公告-2-2008 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定、农业部1486号公告-8-2010 饲料中硝基呋喃类药物的测定，均采用高效液相色谱法测定，其中农业部1486号公告-8-2010的检测限可达0.3mg/kg，定量限为1.0mg/kg。

DB34/T 1838-2013 、DB34/T 1839-2013中分别规定了动物源性组织和水产品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法，仪器采用高效液相色谱配荧光检测器，其中DB34/T 1839-2013 适用于产品的风险预警监测及相关科学研究。

3.2 关于液相色谱-质谱

SN/T 2061-2008 进出口蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定、DB22/T 1614-2012 蛋及乳制品中硝基呋喃代谢物残留量的测定，均规定采用液相色谱-质谱法。

3.3 关于液相色谱串联质谱

GB/T 21311-2007 、GB/T 20752-2006规定了动物源性食品中包括肌肉、内脏、鱼、虾、蛋、奶、蜂蜜和肠衣中硝基呋喃类药物代谢物残留量的检测方法，均规定采用高效液相色谱/串联质谱法测定四种硝基呋喃代谢物AOZ、AMOZ、AHD、SEM的残留，其中GB/T 20752-2006四种残留物的检出限均达到0.5μg/kg。适用于定性确证和定量测定。

农业部781号公告-4-2006 动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定、农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定，也均规定采用高效液相色谱-串联质谱法。

SN/T 2061-2008 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定、GB/T 21167-2007 蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定，也均规定采用液相色谱-串联质谱法。

3.4 关于酶联免疫法

SN/T 3380-2012 出口动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的测定采用酶联免疫吸附法，本标准适用于鸡肉、猪肉、小龙虾、回鱼、牛奶、蜂蜜等动物源食品中AOZ、AMOZ、SEM、AHD残留量的检测。

DB34/T 2253-2014 水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测采用胶体金免疫层析法，适用于鱼、甲鱼、龟肌肉组织和去壳虾、蟹及肠腺的可食用组织中四种硝基呋喃代谢物的快速筛查检测，检出限均为1.0μg/kg。

SB/T 10927-2012 酶联免疫吸附法仅适用于以上产品的风险预警监测及相关科学研究。

4 结论

国内目前对于牛乳中硝基呋喃代谢物的检测技术研究较少，由于牛乳不耐储存，且高脂肪、高蛋白，使得前处理过程中基质干扰多，易于乳化，一般需要较长的流程。因此需要开发一种快捷方便的检测方法，先对牛乳中硝基呋喃类代谢物进行快速筛查，再进一步进行定量分析，以取得更为准确的结果。发光免疫试剂盒技术刚好能满足这一特性，若能进一步提高其灵敏度、准确性、稳定性、回收率，使其接近或者优于液谱检测法，将会有深远意义，值得我们深入研究和开发。