奶牛乳房炎诊断技术的研究进展

张楠楠，张佩华，高明，刘光磊，叶耿坪，王传蓉

( 1.湖南农业大学动物科技学院，长沙 410128；2.光明牧业有限公司，上海 200436；3.上海奶牛育种中心有限公司，上海 200436； )

奶牛乳房炎又称奶牛乳腺炎（Bovine mastitis），是奶牛乳腺受到物理、化学或微生物等刺激所发生的一种炎症反应，其发生范围广、发病率高。据报道，在一些国家，每头奶牛因乳房炎造成的经济损失达107～344美元[1]，所以奶牛乳房炎的控制和治疗策略尤为重要，其中，致病病原体的鉴定是至关重要的基础。引起奶牛乳房炎的致病菌包括细菌、真菌、病毒等，但一般以细菌为主。据报道，在奶牛乳房炎病例中已鉴定出130多种不同的微生物[2]。引起奶牛乳房炎的细菌可分为环境型（大肠杆菌、克雷伯氏菌属和绿脓杆菌等）和传染型（金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性假单胞菌和支原体属等）。90%以上的乳房炎是由金黄色葡萄球菌、链球菌以及大肠杆菌引起[3]。特别是金黄色葡萄球菌，它是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌，在全球各地的奶牛场均普遍存在。金黄色葡萄球菌免疫抑制较强，多在泌乳高峰期感染奶牛，感染的牛只多为慢性发病，但有时也会急性发病，因治愈困难、复发率高，给奶牛场带来严重的经济损失[4]。

1 奶牛乳房炎的诊断方法

奶牛乳房炎通常分为两类：临床型乳房炎和亚临床型乳房炎（即隐性乳房炎）。由于临床型乳房炎眼观明显，所以本文仅对亚临床型乳房炎诊断展开论述。

传统的亚临床型乳房炎检测方法存在耗时长、假阴性结果较多且灵敏度低下等不足。尤其作为乳房炎鉴定的黄金标准——微生物培养，虽然对生物体在抗生素的选择使用方面具有许多优势，但对于密切相关的病原菌鉴定却不是很准确。据Makovec等[5]报道，该方法的变异性较大，在乳房炎乳汁样品的微生物培养中产生了27%～50%的假阴性。正因为这些传统方法的不足，国内外许多学者开展了大量新研究，希望能够更好地完善奶牛乳房炎诊断技术。目前，红外技术、生物传感技术以及纳米技术等新技术已相继应用到该领域，但尚未完全成熟，需要进一步的研究及验证才可应用到实际。在新兴技术中，实时荧光多重PCR在人医和兽医领域都颇受欢迎。该技术检测快速、结果准确，具有高特异、高灵敏度等特点，就目前来看是当前奶牛乳房炎诊断最合适的替代方案。

1.1 红外技术

据Johnzon等[6]研究表明，炎症反应与乳房炎致病因子的毒力相关，但要进一步研究才能找到促炎因子与乳腺炎的关系。Schabauer等[7]报道，傅里叶变换红外（FTIR）光谱技术基于对生物体DNA的识别，通过物种的光谱与参考数据库中已知物种的光谱进行比较，可以区分密切相关的物种。此外，FTIR光谱学还被证明是一种适用于流行病学调查和追踪污染源的工具[8～10]。研究表明，一旦建立并安装了基于该技术的系统，就可以准确且低成本地检测出乳腺病原体，从而可以更早地对临床型乳房炎进行诊断与治疗。目前，这项技术在兽医临床诊断中受到越来越多的关注。Martins等[11]为了寻求简单可靠的检测指标，通过红外热像仪（ITR）进行监测，证明了亚临床型病例与健康奶牛相比具有更高的乳房温度。温度反映了组织代谢和血液循环的状态，异常的热模式表示浅表炎症或循环障碍的区域。ITR监测红外辐射发射的表面热量，而热成像仪吸收红外辐射并根据产生的热量生成图像[12]。在捕获图像前，将相机校准到环境温度且将温度测量值调整为摄氏度，在距离乳房1.0m于挤奶前采集乳房的热像图像，记录下乳房表面最高温度进行分析，从而对患畜与健康牛只进行分类。据研究表明[13]，红外热像仪的敏感性和特异性分别为95.6%和93.6%。虽然其敏感性和特异性很高，但在实际操作中却很费力，且阻碍较多，还有待进一步的研究。

1.2 生物传感技术

在诊断领域，我们不能忽视在乳房炎发病前或治疗前的奶牛行为变化。Avery综合研究结果显示，奶牛在采食量和总体活动方面变化显著，这些变化在临床症状出现前几天就很明显，所以可作为监测的指标[14]。为此，Stangaferro等[15]开发了一种可以记录反刍动物活动与自身健康的自动监测系统，当与其他传统诊断结合使用时，被证明是有效的方法，但需要在管理领域取得进一步进展才能最大限度地发挥效益。Yazdanbakhsh等[16]开发了动物传感器与智能监控相关联的系统，该系统在疾病发作前几天就可以对奶牛进行疾病的监测。然而，常规使用需要进一步推进它的高度特异性和敏感性。Zhang等[17]整合了电子动力学和生物传感技术，有助于达到耗时短、灵敏度高的目的。Ganda等[18]发现其易于执行，结果准确，实际结果与16S rRNA测序结果相当。随着该系统的进一步发展，用于乳房炎诊断将在牧场中变得更加可行，特别是在诊断与乳房炎相关的微生物群体上，可以观察到具有不同疾病状态和疾病史乳头的细菌群落的显著差异。通过采取预防措施，可以改善牛群的健康状况，从而提高农业生产力和动物福利。

Chinnappan等[19]开发了基于磁性纳米颗粒的量热测定法用于检测乳中的纤溶酶水平。纤溶酶是一种热稳定的内源性丝氨酸蛋白酶，无论涉及何种病原体，它都会释放出来[20，21]。随纤溶酶水平的增加，底物被切割，肽片段附着在磁性物上的珠子将被传感器下面的磁铁吸引，露出金色表面。研究发现，金色表面的面积与纤溶酶活性成正比。因此，该方法主要就是通过比色分析来区分健康牛与患牛。这种比色生物传感器反应快速、简单、敏感，在乳腺炎诊断过程中有很强的潜力且可能用作初始阶段的诊断。Peedel和Rinken[22]设计了另一种用于快速检测金黄色葡萄球菌的生物传感器。它由可再生的微柱和用于选择性结合靶细菌的二抗和共轭荧光标记物组成。Duarte等[23]基于磁性纳米粒子与特异性抗体的结合特性，采用具有微流体样品的磁阻细胞仪检测金黄色葡萄球菌，与常规方法相比，提高了效率。

1.3 蛋白质组学分析

基于基因分析的乳房炎诊断方法正变得越来越频繁。基因分析可用于测试已从牛奶中分离的细菌，或直接检测其在牛奶中的存在[24]。当代科学用可以识别乳腺炎症状的生物标志物设计新的诊断测试，以快速检测出乳腺感染，而蛋白质组学分析就是这些工具之一[25，26]。研究表明，亚临床型乳房炎乳清中的蛋白质表达模式较健康牛只发生了改变[27]。急性期蛋白（APP）是在急性炎症反应期间在肝脏中构建的蛋白质，在正常状态下较低，但在各种炎症的刺激下会迅速升高，而当病愈或得到有效治疗时其水平又会立即恢复正常。反刍动物最为敏感的急性期蛋白是结合珠蛋白（HP）和血清淀粉样蛋白A（SAA），这两者在急性炎症发生时会大量增加。有研究指出，乳汁中SAA的增加最为明显[28]。Hussein等[29]则研究发现MAA（乳淀粉样蛋白A）优于其他亚临床型乳房炎诊断标志物，优势在于健康动物乳汁中微量甚至检测不到的MAA水平，它不受乳房炎以外的其他因素的影响，并且可以在保存的样品中估计，为临床型乳房炎的诊断提供了有力的证据。Mansor等[30]报道，这些生物标志物可以作为准确区分健康和患病状态的潜在候选者，并能提供有关致病因子的一些信息。在最近报道的一项研究中，使用无标记定量的方法可以确定由乳房链球菌引起的乳中蛋白质表达的相对变化，与先前的报道相比，已经证明它更有利并且能够提供关于宿主对奶牛乳房炎更全面的信息[31]。

1.4 分子诊断

分子诊断是用于检测常规方法难以检测的乳房炎病原体物种的一项检测技术，包括LAMP、PCR和多重实时PCR等技术。这些基于核酸的检测依赖于各种病原体的基因组序列。LAMP技术由Notomi等人开发，它是一种新型的DNA扩增方法，可以在等温条件下扩增靶基因[32]。Sayad等[33]研究发现，LAMP（环介导）具有钙黄绿素介导的量热无线检测系统，可在65min内有效检测病原体，尤其适用于金黄色葡萄球菌的快速检测。环介导等温扩增技术反应快速、经济、耗时短，其局限性主要是灵敏度低。在过去几年中，它在诊断领域获得了很大的普及，很有潜力被用作现场检测，但在灵敏度的改良上仍然需要国内外学者的共同努力。

与其他检测技术相比，PCR（聚合酶链式反应）诊断技术的特异性和敏感性优势十分显著，是目前奶牛乳房炎临床诊断中比较先前的一种分子水平检测方法，Phuektes等[34]建立的一种以16S～23SrDNA间隔区为扩增靶序列的多重PCR检测方法，依据16S～23SrDNA在不同种的细菌中拷贝数、长度、碱基排列顺序及含有的tRNA基因的数量和种类不同，可判断致病菌的种类。PCR不仅可以检测细菌的种类和重要的抗生素抗性基因，还可以检测霉菌和病毒，也可用于混合培养。传统PCR的缺点是在DNA扩增检测中使用琼脂糖凝胶，其分辨率非常差[35]。而多重实时PCR则在传统PCR的基础上进行改进，通过荧光定量分析仪对提取的DNA进行扩增，经过50℃、3min去污染，95℃、3min预变性，95℃、10S扩增和60℃、40S退火等40个循环，根据分析软件的Ct值就可以客观地解释各致病菌种的阳性结果。Mahmmodp等[36，37]报道，奶牛乳房炎致病菌阳性结果的数量与Ct值截止值的选择相关，与剂量反应效应相当。现国内少数地区已使用该项检测技术监控亚临床型乳房炎，如上海就是通过PathoProof乳房炎多重PCR诊断系统对单一反应孔16种重要的病原菌进行基因诊断。该16联牛乳房炎病原菌核酸检测采用TaqMan探针实时荧光PCR技术，针对引起牛乳房炎常见的病原菌特有的DNA保守区域设计特异性引物和TaqMan探针，通过PCR扩增观察是否产生级联放大荧光信号可快速准确地检测牛奶样品中引起奶牛乳房炎的病原菌种类。多重PCR主要用于常见的炎症病原体，与传统培养相比，PCR诊断技术敏感性高、特异性强、检测方便、耗时短且结果更加准确。

2 展望

近几年来，奶牛养殖行业发展迅速，规模不断壮大，但随之而来的疾病也在不断高发，仅乳房炎就给牧场造成巨大的经济损失。国内外许多学者为了更好地诊断和维护乳房的健康，在生物传感器技术领域做了很大的投入，并取得了相当大的进步，特别是基因组学和蛋白质组学方法的结合，以及纳米治疗技术和其他传感器的进一步参与，将有助于寻求更好的乳房炎诊断工具。就目前的诊断方法而言，多重实时PCR检测，反应快速、结果准确且特异性强、灵敏度高，是当前用于奶牛乳房炎诊断的最合适的替代方案。当前，虽然奶牛乳房炎诊断技术不断进步，成果颇多，但推广力度始终不够。所以为了突出这些技术在奶牛行业的影响，应该提供更多的理论知识和指导来传递这些新颖的先进技术，使这些技术不仅仅只局限于少数实验室，而是能真正走进各大牧场，走进奶牛行业。