褪黑素对家畜冻精品质影响的研究进展

2019-01-08张幸怡林聪刘祯苏衍菁刘光磊

中国奶牛 2019年3期

张幸怡，林聪，刘祯，苏衍菁，刘光磊

（光明牧业有限公司，上海 200436）

早在20世纪时，国内外学者便开始研究家畜精液的冷冻技术，目前精液冷冻技术经过多年来的研究与发展，其技术已经相当成熟，并与人工授精技术相结合，广泛应用于家畜的繁育工作，能够快速增加优质高产家畜的数量，具有较高的商业价值。但在冷冻精液的制作和使用中往往会产生ROS（活性氧）等有害物质，使精子活力及受胎率明显不如新鲜精液，低质量的冷冻精液会明显降低家畜的受胎率，阻碍畜牧业的快速发展。

1 影响冻精精液品质的因素

影响冷冻精液品质的因素有很多，大致可分为两类，一类是来自动物本身之间的个体差异，一类是来自冷冻保存过程中的外在因素。

1.1 个体差异因素

动物的受精率和胚胎发育与动物个体有关，不同的个体会出现不同的结果。种畜的饲养就是为了延续优良性状，其途径就是通过精液遗传，而精液品质的高低直接影响优良性状的延续，与种畜的使用价值密切相关。不同种畜的精液浓度、精子活性和精子形态等指标不尽相同，而精子质量好的种畜，更有可能产生人们需要的理想性状的后代。关于个体差异对精液品质影响的研究较早，郝爱玲等发现不同品种种公牛精液品质差异较大，在采精量、鲜精活力、精子密度、冻后活力、生存时间和精子畸形率方面都有不同程度的差异[1]。谢庄等通过对不同国别种公牛精液品质的分析，得出饲养在同一状态下的不同国别的种公牛精液品质存在差异的结论，其中中国的种公牛精液质量不如其他国家，加拿大种公牛的精液质量不如日本、美国和德国等国家[2]。

1.2 外在因素

冷冻精液在制作过程中，精液品质会受到不同制作工艺的影响。冷冻保存过程中的外在因素主要包括精子稀释液组成成分、冷冻保护剂的种类、解冻方法、平衡时间以及在体外操作过程中产生的ROS（活性氧）等有害物质。研究发现，精子在冷冻-解冻后，其活力及受胎率明显不如新鲜精液，这是因为精子在这一过程中受到了冷冻损伤，其中氧化损伤是影响精子生理机能的主要因素之一[3]。精子在冷冻-解冻过程中产生过多的ROS，影响精液品质，降低奶牛受胎率。针对该问题，国内外学者通过在精子稀释液中添加外源抗氧化剂，以期提高解冻后精液品质，例如添加维生素E、维生素C、维生素B12、抗氧化物酶、丁羟甲苯、谷胱甘肽、海藻糖和褪黑素等。其中褪黑素是一种具有较强抗氧化作用的胺类物质，可通过清除多种ROS，激活多种抗氧化系统，以保护精子膜因冷冻-解冻过程所引起的氧化损伤，提高精子冻后品质[4]。

2 褪黑素概述

褪黑素（melatonin，MLT）是由哺乳动物和人类的松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌素，是色氨酸的衍生物，能够使一种产生黑色素的细胞颜色变浅，因而命名为褪黑素。有研究表明，视网膜、肠和副泪腺也可少量合成褪黑素；某些变温动物的眼睛、脑部和皮肤（如青蛙）以及某些藻类也能合成褪黑素[5]。褪黑素具有高度的亲脂性和部分亲水性，能穿透生理屏障发挥生理及病理作用。研究发现，褪黑素具有较强的抗氧化作用，并有抗肿瘤、改善睡眠机制、提供免疫功能和生物节律性的功效。

活性自由基（ROS）是一类稳定性差、半衰期短且化学性质活泼的物质，由机体通过酶促反应和非酶促反应产生。机体内适当数量的自由基可保证生物体正常的生理过程，具有一定的免疫、信号传导和调节新陈代谢的功能。但当机体受到有害刺激时（辐射、光照及其他外源性或内源性诱因），体内ROS含量的动态平衡会发生破坏，ROS含量增多，会造成体内正常细胞和组织损伤，破坏生物体正常生理过程，引发一系列疾病。褪黑素作为一种抗氧化剂，是一种强大的内源性自由基清除剂，能够对抗羟自由基对机体的攻击以及谷氨酸兴奋毒性作用，对中枢神经系统有保护作用。一方面，褪黑素通过与自由基的结合来清除自由基，并通过一系列过程形成其他抗氧化成分。这使得褪黑素在被氧化的过程中，中间产物也具有抗氧化的特性，从另一层面上增加了褪黑素的抗氧化效果。据报道，褪黑素可保护由黄樟素所引起的DNA损伤[6]。高超的研究发现，褪黑素可抑制因百草枯所引发的过氧化反应及产生的自由基造成的细胞癌损伤[7]。另一方面，褪黑素可以保护机体内存在的众多抗氧化酶类，促进抗氧化酶类活性的提高（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶），保障抗氧化酶类催化还原物质的生成或对自由基的清除过程。研究表明，褪黑素可显著提高中毒性肝炎小鼠体内谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶的活性[8]。Armagan等以糖尿病小鼠为研究对象，发现褪黑素可提高糖尿病小鼠睾丸中超氧化物歧化酶及过氧化氢酶的活性[9]。褪黑素在机体内的各种生理及病理过程中最终成为最强大的内源性自由基清除剂。目前，褪黑素作为一种保护剂，已被广泛应用于因各种自由基所造成的组织损伤[10]。

3 褪黑素在改善冻精品质上的研究进展

有研究表明，褪黑素作为一种功能强大的抗氧化剂，可以提高精子线粒体活性、精子活力和顶体完整性，能够在精液冷冻-解冻的过程中清除过多的ROS，提高精子质量[11]。国内早在2004年便有关于褪黑素的抗氧化作用对精液品质影响的研究。商学军等的研究表明，褪黑素通过其抗氧化能力，有效降低了ROS对精子线粒体功能的损伤[12]。近年来，褪黑素通过强大的抗氧化能力改善精液品质的研究渐渐成为热点，有研究学者发现，褪黑素对精子的保护作用可能与其可穿过质膜、清除自由基和减少氧化应激有关；也可能是通过质膜受体发挥作用[13]。国内外已有许多将褪黑素应用于家畜冷冻精液保护中的相关报道，探究褪黑素对精子的保护作用。

3.1 褪黑素在猪精液上的应用

杜立银等在经冷冻保存的猪精液里添加适宜浓度的褪黑素，发现褪黑素具有抑制精子氧化损伤，提高解冻后精子活率、质膜完整性和顶体完整性，显著提高精子品质的功能[14]。另外，褪黑素既可作为单独的成分提供抗氧化能力，也可与其他抗氧化性物质结合提高抗氧化性。杨宝卫等通过研究猪精液冷冻稀释液配方发现，10mmol/L的褪黑素和不同浓度的褪黑素和盐酸多巴胺混合物（0.1、1和10mmol/L）均能有效改善冻后猪精子的畸形率和顶体完整性，有效改善解冻后猪精液品质[15]。李博玲等的研究也表明，添加适量褪黑素能抑制猪精液冷冻过程中ROS的产生，且褪黑素与其他抗氧化物质的联合能有效提高抗氧化性[16]。Jang等将褪黑素分别添加至含有过氧化氢及无过氧化氢的公猪精液中，在37℃条件下培养3、6、9、12h，结果表明，精液中添加褪黑素组中的精子运动性、精子活力、精子存活率、膜完整性及线粒体活性均高于未添加组。进一步佐证了褪黑素可保护公猪精液在冷冻保存过程中免受氧化损伤，提高公猪冷冻精液品质[17]。

3.2 褪黑素在牛精液上的应用

李晓霞等通过在牛精液稀释液中添加不同浓度的褪黑素，经过冷冻-解冻等一系列处理后发现：与对照组相比，10-3mol/L褪黑素可明显改善牛精子活力、质膜完整率和顶体完整率，提高牛精液的保存时间和保存质量[18]。Li等通过研究褪黑素在性控精液生产中对水牛精液品质的影响得出，褪黑激素有助于保护水牛精子免受染色、分选和冷冻过程中产生的活性氧的伤害，减少精液因ROS引起的氧化损伤，改善了分选和冷冻-解冻后的精子质量，从而有助于优化性控精液分选程序以及性控精子分离的应用[11]。孙业清的试验表明，经过褪黑素处理的牛冷冻精液，能显著降低冷冻-解冻过程中精子细胞产生的ROS含量，提高精子质膜、线粒体膜及顶体完整率，有效改善精液品质[4]。Ashrafi等研究发现，在牛精液稀释液中添加褪黑素可有效改善精子形态，显著提高解冻后的精子活力及直线运动比例[19]。

3.3 褪黑素在羊精液上的应用

Ashrafi以公羊精子为研究对象，探究在5℃、保存48h条件下，褪黑素对精子运动参数的影响。结果表明，公羊精子稀释液中添加适量的褪黑素可显著提高公羊精子的运动参数[20]。kaya的研究表明，褪黑素可有效提升公羊精子冷冻-解冻后的精子存活率，同时与对照组相比，添加褪黑素可显著降低精细胞中碱性磷酸酶的流失[21]。Hanif的研究发现，在公羊非繁殖季节给予褪黑素处理，可有效改善公羊精子品质[22]。另外Webster观察到，相比于对照组，经过褪黑素处理的公羊精子，在50d后其精子个体的运动率较高[23]。Succu的研究表明，褪黑素可显著提高精子DNA完整性及ATP浓度，提高冻后公羊精子活力[24]。