CCR3的缺失导致阿尔茨海默病小鼠模型中β-淀粉样蛋白和过度磷酸化tau蛋白的减少

隋 轶 张 尧 徐 冰 *

（沈阳市第一人民医院神经内科（沈阳医学院附属沈阳脑科医院、沈阳市脑病研究所），辽宁 沈阳 110041）

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性记忆障碍为突出表现的中枢神经系统退行性变疾病，占所有痴呆的60%～70%。AD的主要病理标志包括由星形胶质细胞和微胶质细胞包围的细胞外β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积共同构成的老年斑，以及由过度磷酸化的tau组成的神经原纤维缠结。越来越多的证据表明，由活化的星形胶质细胞和小胶质细胞产生的趋化因子似乎在AD的发病机制中起重要作用[1]。不同的趋化因子可能在AD的发病机制中发挥不同的作用。CCL11是可能参与AD病理学的一种重要趋化因子。CCL11在衰老过程中已被证明在血清中逐渐升高，其年龄依赖性增加与海马依赖性学习和记忆任务的缺陷相关。CCL11与一种由星形胶质细胞，小胶质细胞和神经元表达的趋化因子受体，CCR3结合[2]。在本研究中，我们拟应用APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠证实CCR3介导了AD病理中的β-淀粉样蛋白和过度磷酸化tau蛋白的产生。

1 材料与方法

1.1 动物：为获得CCR3基因缺陷小鼠（APP/PS1/CCR3-/-），将杂合的APP/PS1小鼠连续与CCR3-/-小鼠杂交，随后进行交叉。

1.2 免疫组化：处死的小鼠大脑固定在含有4%多聚甲醛和15%甘油的磷酸盐缓冲盐水（PBS）细胞保护剂中。在冷冻切片机上切割切片（50 μm），在PBS中充分洗涤并作为自由漂浮的切片处理。通过将切片，在含有0.5%Triton X-100和3%牛血清白蛋白的PBS中，在室温下温育1 h来实现渗透和阻断。漂洗后与相应抗体共浴。

1.3 体视学细胞计数分析：应用荧光或光学显微镜进行体视学分析，油浸100×物镜。使用如前所述的无偏立体细胞计数技术的光学分离器方法计数海马中Aβ斑，星形胶质细胞，小胶质细胞和p-Tau阳性神经元的数量。

1.4 蛋白质印迹分析：将细胞或脑组织在含有蛋白酶抑制剂混合物的TBS（20 mL Tris-HCl缓冲液，pH 7.4，150 mL NaCl）中匀浆，包括0.5 mL苯甲基磺酰氟，20 μg/mL抑肽酶，20 μg/mL亮抑酶肽，20 μg/mL胃蛋白酶抑制剂和1 mL EDTA。将匀浆物短暂超声处理并以15000×g离心30 min。在还原条件下，将样品（每泳道10 μg蛋白质）在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有0.1% Tween 20，3%干乳的TBS封闭膜1 h，然后在室温下用特异性抗体孵育2 h。洗涤后，将印迹与相应的HRP标记的第二抗体一起温育1 h。

1.5 统计分析：用SPSS18.0对数据进行统计分析，数据表示为平均值±SEM。分析是使用双因素方差分析进行，然后进行Fisher最不显著差异事后分析，以确定显著的效果。P＜0.05被认为达到显著统计学差异。

2 结 果

2.1 CCR3缺陷减少了APP/PS1双转基因小鼠中的Aβ的产生和沉积以及相关的小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生：为检查在AD小鼠模型中CCR3对Aβ产生和沉积的影响，我们将CCR3-/-小鼠与APP/PS1双转基因小鼠杂交以产生APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠及其同窝小鼠。我们比较了这些动物（12个月大）的大脑中的Aβ沉积和相关胶质增生。应用Aβ42抗体的免疫组织化学和体视学分析表明，Aβ沉积物在WT和CCR3-/-小鼠中无法被检测出，然而其在APP/PS1双转基因和APP/PS1/CCR3-/-三重突变体小鼠的皮质和的海马中却可以被检出。同时APP/PS1双转基因鼠脑内Aβ沉积显著高于APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠。我们还观察到，在APP/PS1/CCR3-/-三重突变体小鼠和APP/PS1同窝小鼠中，绝大多数的Aβ形式是～40聚体，～20聚体，四聚体和三聚体，以及中等的单体水平。有趣的是，与APP/PS1同窝相比，在APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠的Aβ三聚体，四聚体，和40～聚物显著减少。在这个AD小鼠模型中，Aβ沉积物被活化的星形胶质细胞和小胶质细胞包围，即星形胶质细胞增生和小神经胶质细胞增生，它们被认为是神经炎症的主要来源。有趣的是，与APP/PS1同窝小鼠相比，在APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠中观察到了明显减少的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。

2.2 APP/PS1双转基因小鼠中的CCR3缺陷降低tau过度磷酸化：与野生型同窝小鼠相比，APP/PS1双转基因小鼠的海马组织中包括T181、T205、S199和S235在内的多个部位的tau蛋白过度磷酸化显著增加。有趣的是，与APP/PS1双转基因小鼠相比，APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠表现出tau的过度磷酸化显著降低。使用抗p-tau抗体（T181）的免疫组织化学和体视学分析，我们证实APP/PS1/CCR3-/-三重突变小鼠海马中p-tau阳性神经元明显少于APP/PS1同窝小鼠。

3 讨 论

在本研究中，我们证明了，在APP/PS1双转基因小鼠中，CCL11受体CCR3的缺乏显著降低了Aβ的产生以及相关的小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生，tau蛋白过度磷酸化。因此，趋化因子受体CCR3介导了AD的重要病理变化的发生。

在AD患者的大脑中，tau异常过度磷酸化，并且在这种改变的状态下，它聚集成成对的螺旋状细丝，形成神经原纤维缠结。此外，新皮质中神经纤维缠结的密度与痴呆相关[3]。因此，开发合理的基于tau的治疗药物需要识别tau异常过度磷酸化的触发因素并理解其内在机制。趋化因子似乎是涉及tau病理学的重要因素。现在，我们提供证据证明CCL11/CCR3在tau蛋白过度磷酸化中发挥作用。除了tau蛋白病理外，由Aβ沉积物和周围活化的小胶质细胞和星形胶质细胞组成的老年斑是AD的另一个重要标志。Aβ沉积被认为是小神经胶质细胞和星形胶质细胞增生的主要触发因素，这二者都有助于神经炎症的发展。在APP/PS1双转基因小鼠的脑中，我们观察到CCR3缺乏显著降低Aβ的水平，主要是它的低聚物形式。最后，我们观察到CCR3缺陷显著降低小神经胶质细胞和星形胶质细胞增生，表明对CCL11/CCR3的早期干预可能减少AD患者脑中的神经炎症。