生殖激素检测应用于国内动物园繁殖监测实践的可行性分析

2019-01-08刘永张

野生动物学报 2019年1期

杨梅刘永张

(昆明动物园，昆明，650021)

野生动物成功繁殖是其适应环境的具体表现，也是动物维持其种群的重要策略。动物园人工圈养条件下野生动物的合理繁殖、种群建立及可持续发展，不仅是行业发展的基础，更是对就地保护的贡献。随着中国动物园全行业管理理念、饲养技术、设施设备和人才队伍的不断发展，基于生殖内分泌学基础开展的人工圈养下野生动物的繁殖监测得到长足发展，获得了非常宝贵的初始数据，为人工圈养物种更加科学规范管理打下了坚实基础。同时，目前仍不属于常规操作的生殖激素检测分析工作，在日常饲养管理中也凸现出一些现实困难和问题，如何结合现阶段中国动物园行业发展不平衡的现状，考虑圈养野生动物的成本与效益，对激素分析监测实践中细节工作进行分析，探讨在日常饲养管理中推广应用的可行性，寻求更有效的操作方法与策略，让野生动物的繁殖监测更加科学化、客观化，可作为传统动物园向现代动物园转变、单个动物园管理向动物园行业管理转变过程中的示范载体之一。

1 野生动物生殖激素检测与繁殖监测的相关性

引起动物繁殖行为的最直接内分泌因子是生殖腺分泌的性激素。由两性动物体内睾丸和卵巢分泌的性腺激素主要功能可归纳为：促进动物第二性征的发育并维持；促进动物的性行为和发情表现；促进生殖器官的周期性变化[1]。随着动物的生长，性激素通过长期、持续的调节过程，形成动物的生殖生理规律。实践中主要监测分析的雌性激素有雌二醇(estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)和雌酮(estrone，E1)，对动物的繁殖周期有调节作用，能够控制繁殖周期，启动雌性动物的繁殖行为。分析监测孕激素中的孕酮(progesteron，P)对于准确判定雌性动物妊娠分娩具有重要作用。雄性激素监测中最重要的是由睾丸分泌的睾酮(testosterone，T)，对雄性性行为和性欲表现起促进作用。按化学性质分类，雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、雌酮(E1)、孕酮(P)和睾酮(T)都属于类固醇(甾体)激素(steroid hormone)类[1]。促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的主要靶细胞是睾丸，其主要功能是促进睾丸间质细胞的增生，促进其合成和分泌雄性激素，主要是睾酮(T)。所以，对促黄体生成素(LH)含量变化进行监测，也可起到间接监测睾酮(T)水平变化、监测繁殖状态的作用。

由于技术的进步和分析手段的不断提高，通过对动物体内性腺激素水平变化的监测，判定繁殖状态、发情周期、妊娠产仔等，进一步开展人工授精、体外受精和胚胎移植，提高动物生产力，已成为畜牧业的重要手段。近年来，随着对野生动物生殖生理研究的不断深入，野生动物生殖激素的分析、检测，生殖激素与生殖行为的相关性等研究也受到越来越多的关注。Bonney等通过测定一对大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)连续2个繁殖季尿液中雌、雄激素含量及变化，证明了大熊猫的发情行为与内分泌及相关激素相关联[2]。Moore探讨了应用于雄性动物繁殖策略选择的基于激素作用的组织激活理论[3]。Freeman等探讨了圈养亚洲象(Elephasmaximus)和非洲象(Loxodontaafricana)在群体中的行为、支配地位及卵巢活跃度之间的相互关系，提出象的圈养管理需更加聚焦于社群和环境状况的优化，以最大限度提高繁殖潜力[4]。从这些研究中可以看到，野生动物生殖激素同样是其繁殖活动的重要生理基础之一，对野生动物(尤其是珍稀濒危物种)繁殖活动进行有效监测，可促进野生动物保护管理和资源可持续利用。

当然，由于动物体内的生殖激素含量属微量，其分泌在一定程度上受生物节律、季节、应激强度、持续时间等因素影响，分泌后一般很快被利用或分解，不在体内存留，并通过尿液、胆汁或粪便排出体外。所以，采用何种有效的检测手段、方法，同样值得关注。李春等认为，相对于血液、毛发、尿液等样本，利用动物粪便研究类固醇激素具有完全无伤害性、材料收集容易等其他方法无可比拟的优点，粪便类固醇代谢有以下作用：(1)评估青春期的健康状况；(2)可获得关于季节性繁殖、发情周期和发情时间、未孕黄体期的时间长短、妊娠周期的准确信息；(3)可判断动物的排卵方式(自发排卵或诱导排卵)；(4)早孕诊断、预测产期；(5)确定生殖活动不活跃和过渡活跃的原因；(6)以评估动物生理压力为工具来提高其生殖潜力，同时，评估并提高动物栖息地环境状况，以促进其健康[5]。因此，对野生动物粪便类固醇激素进行监测是一种较为理想的方法，为长期监测动物生殖活动提供了可能性。

李春旺等[6]在探讨江苏大丰麋鹿保护区麋鹿(Elaphurusdavidianus)繁殖行为与粪样激素水平变化关系时曾表述过：“性激素在血浆和粪样中的浓度有很高的相关性；Lasley等[7]认为多数动物的性激素在血液和粪样中的相关性是较高的；张志华等[8]发现母狒狒(Papiosp.)血浆、粪样雌二醇及孕酮的相关系数分别为0.92和0.82，这充分证实由粪样提取分析性激素的可信度是相当高的。”并在实验中用放射免疫分析法测定了粪样中的睾酮(T)、孕酮(P)、总雌二醇(E2)和总雌三醇(E3)，证实了麋鹿粪样中的性激素水平变化与繁殖行为的季节性变化密切相关[6]。

高云芳等以秦岭一野生川金丝猴(Rhinopithecusroxellana)种群为研究对象，结合采样个体的性行为观察，对秦岭不同季节野生雌性川金丝猴粪便中睾酮水平进行了测定，以探讨睾酮水平变化与邀配频次的季节性变化，进一步验证了雌性体内睾酮水平与性行为之间的可能关系[9]。

兰天在新疆野马繁殖中心以普氏野马(Equusprzewalskii)为研究对象进行繁殖生理监测，寻找符合普氏野马生存环境气候特征的粪便样品保存方法，认为采用乙醇常温保存该物种粪便内类固醇激素是一种较好的选择，适用于目前新疆卡拉麦里自然保护区放归野马的繁殖监测[10]。

鸟类由于特殊的排泄器官和排泄方式，其粪便和尿液混合在一起排出体外，近年来从鸟类粪尿混合排泄物中提取类固醇化合物进行分析监测的方法已应用于对多种野生鸟类的监测研究。Touma等认为测定哺乳类粪便和鸟类粪尿混合排泄物中甾体激素代谢物这一方法能够作为实验室、农场、动物园、野生动物保护机构等评估不同动物肾上腺皮质活跃情况的有力工具[11]。Staley等通过测定金雕(Aquilachrysaetos)和游隼(Falcoperegrinus)粪尿混合排泄物中类固醇激素含量变化以监测性腺和肾上腺状况，并认为这是一种对珍稀濒危猛禽进行监测的有效的、有前途的工具[12]。张雁云等就通过收集和测定笼养黄腹角雉(Tragopancaboti)粪尿混合排泄物类固醇化合物，以监测性激素水平变化，进一步证明鸟体内促性腺激素、甾体激素的水平会随着繁殖周期中性腺的成熟和衰退而发生同步性波动；通过对粪尿样中性激素的分析发现，雄性黄腹角雉的许多繁殖行为如求偶炫耀、领域行为、走动等的发生频次与粪便中睾酮质量分数显著相关；雄性黄腹角雉的射精量与其粪便中睾酮质量分数的变化相一致；表明黄腹角雉两性个体粪样中雌二醇和睾酮质量分数之比存在显著差异，因而在野外研究中，利用粪尿混合样内雌雄激素的比值进行性别鉴定、了解种群结构是可行的[13]。

2 国内动物园相关工作进展

中国动物园在濒危野生动物的饲养、繁殖方面开展了大量的研究，成功繁殖了中国鹤科(Gruidae)、鹳科(Ciconiidae)、洞角科(Bovidae)、鹿科(Cervidae)、马属(Equus)、灵长类(Primates)动物等，许多中国特有动物已经在中国动物园系统形成了可繁殖群体，如华南虎(Pantheratigrisamoyensis)[14-15]；一些极度濒危的动物，如大熊猫，全国动物园针对其繁育开展了技术协作；成功繁殖了很多国外引进动物，如斑马(Equusburchelli)、长颈鹿(Giraffacamelopardalis)等[16]。事实证明，中国动物园行业在不断推进圈养物种科学管理等工作中取得了显著成绩，已成为濒危物种易地保护的重要基地。

在这一进程中，借鉴目前野生动物保护实践领域的相关研究，中国动物园系统也开展了人工圈养条件下不同种野生动物的生殖生理研究，其中发展最为成熟、全面的是随着人工种群成功建立和野外保护深入发展的大熊猫。在过去30年中，通过非干扰性内分泌检测技术的逐渐运用，对大熊猫独特的繁殖特点已有了较为准确地掌握。随着研究的不断深入，基于内分泌学基础的激素测定与分析，研究范围已涉及了个体发情期生殖内分泌变化规律研究[17-25]、应激管理[26-27]、圈养行为成因分析[28]等。为了更进一步掌握大数量样本的情况，罗娌等追踪了大熊猫30次妊娠的情况，发现大熊猫的整个妊娠期可以分为3个部分，且找到了每个部分孕激素变化规律[29]。可以说，目前对大熊猫的保护管理已建立起了能够比对的基础数据库，为其日常管理、保护决策提供了准确依据。据2017年7月中国林业网报道，中国大熊猫保护研究中心在大熊猫雌激素检测方面取得了长足进步，繁殖生理研究室通过对酶联免疫法改变实验步骤，改进实验方法，研究探索缩短检测时间的方法，把原来一般需耗时120～150 min的检测时间缩短到了40～50 min，将对提升大熊猫发情监测的时效和指导适时配种起到十分积极的作用。

相比大熊猫，目前国内动物园对其他野生动物生殖激素的分析监测研究，基本都是针对单一物种、短期状态、无连续性的各家动物园自行开展、零星报到，深入度不够，尚未形成系统工作。综合相关文献报道，国内外对人工圈养条件下野生动物生殖激素进行过分析监测的动物大致有：旧大陆猴、猫科(Felidae)、麋鹿、小熊猫(Ailurusfulgens)、狒狒、倭黑猩猩(Panpaniscus)、白面僧面猴(Pitheciapithecia)、北豚尾猴(Macacaleonina)、棉顶绒猴(Saguinusoedipus)、食蟹猴(Macacafascicularis)、加拿大盘羊(Oviscanadensis)、麝牛(Ovibosmoschatus)、北美野牛(Bisonbison)、云豹(Neofelisnebulosa)、猎豹(Acinonyxjubatus)等。据不完全的文献资料，通过对国内人工圈养条件下小熊猫[30-33]、东北虎(Pantheratigrisaltaica)[14-15，34]、华南虎[35-36]、亚洲象[37]、黑熊(Ursusthibetanus)[38]、狼(Canislupus)[39]、丹顶鹤(Grusjaponensis)[40]、朱鹮(Nipponianippon)[41-42]、大鸨(Otistarda)[43]等动物血清或粪、尿样品中类固醇激素的测定分析也取得可喜进展。

由于雌性川金丝猴经期没有性皮红肿现象，经血量也非常少，且腹部肥大，即使是人工圈养下也很难通过观察判断月经周期和明显的妊娠体态变化，因此，阎彩娥等通过测定尿液中雌二醇、孕酮相对含量变化，对动物园圈养的川金丝猴不同时期的生理状态进行了监测，根据雌二醇在排卵前的一个明显高峰，由两个雌二醇高峰之间的间隔推断出月经周期为(28.33±1.67)d；依据雌二醇水平的变化情况与分娩日期，推测的妊娠期约为200 d(193～204 d)，存在个体差异；受试样本动物实际产仔日期与预测日期基本一致[44]。任宝平等跟踪测定了上海野生动物园一个半放养川金丝猴群3个成年雄性川金丝猴的睾酮浓度，发现雄性睾酮水平出现高峰期与雌性的繁殖交配盛期基本不重叠，说明雄性大量分泌睾酮更多的是由其社会环境的变化引起的，提示在川金丝猴中繁殖活动的时间主要由雌性个体来调节[45]。黎绘宏等对1只雌性黑猩猩(Pantroglodytes)的月经周期和性皮肿胀情况进行了长达3年的观察记录，并测定尿液中促黄体生成素(LH)含量变化，以预测黑猩猩排卵期，为适时配种提供科学参考[46]。

从这些实验结果中再次证明：虽然存在物种、个体、饲养状况等差异，但性腺激素能够调节野生动物的生理机能，对野生动物的生殖状态具有指示作用；对其进行科学监测，对动物园日常饲养实践具有非常重要的指导意义，将为动物园合理开展圈养动物的繁殖工作提供科学保障。

3 存在的问题

监测野生动物性腺激素与生殖行为的关系，最理想的方法是结合动物的行为观察，经过一个长期持续的过程，连续采集一个物种若干个体同期血液样本，测定其中的性激素含量，才能准确描述出一个客观变化规律。而且由于野生动物种间差异很大，因此最终为每个物种建立自己的基础数据才可能为准确判断其生理状态提供科学参照。遗憾的是，由于主客观条件限制，现阶段中国动物园全行业在饲养实践中尚不能达到这一理想状态，仍存在一些实际困难和问题。

3.1 样本的取得

直接采集动物血液测定激素水平，具有简便、快捷、准确的优点，在畜牧业、宠物业、实验动物和人类的疾病监测中是应用最为广泛、高效、传统的方法。但对于在动物园中呈现拟自然状态的野生动物而言，应激水平一般较高，在日常饲养管理中如要经常性地捕捉、保定并静脉穿刺获取血液组织，本身就会导致其生理指标的异常，在实际操作中存在很大的难度和隐患。

首先，采集血液样本的过程本身就是一个强有力的应激源，会导致动物机体产生较强的应激反应。其次，配合采血而使用的一切物理保定措施，对动物来说都是一个激烈的刺激。第三，麻醉剂会抑制动物神经功能和影响垂体的分泌，进而影响激素分泌，经常性地对动物实施麻醉没有现实性和可操作性。第四，经常性地保定、采血会极大地干扰动物的正常状态，造成生理和心理的损伤。

目前，采集野生动物的尿液和粪便样品测定性激素这种非损伤取样法，在圈养野生动物的研究中应用较多，优点是对动物机体无损伤，不会对野生动物的正常状态造成较大干扰，且可以在一段时间内有规律的收集，是研究激素水平变化最理想的样品选择。但是，群居动物特定个体尿液、粪便的准确识别，动物排泄的随机性，圈养笼舍地面环境的限制，甚至不同地域饲养方式、饲料品种差异，都会对样本造成干扰，进而干扰测定结果，是需要注意的因素。随着动物园展示方式的不断改变，集群饲养、甚至是混群饲养会越来越多地出现在城市动物园中，在进行目标动物粪尿样品采集监测过程中，由饲养员根据日常特征区分、利用高清监控设备辨识目标个体，提前合理分隔监测小群、选择适当笼舍，确定稳定的日粮组成等，均应纳入到激素监测方案中，并不断完善。

3.2 激素测定的操作成本

常用的激素测定方法主要包括生物学方法、化学方法和免疫测定方法。其中，已经用于检测粪样中性激素含量的免疫学方法有放射性免疫检测法和酶联免疫检测法。由于放射性免疫检测灵敏度高，方法成熟，因此测量结果可信度高，是目前应用最广泛的性激素测定方法。但在应用这一方法时，会产生不同程度的辐射环境影响，因此，对实验室防护条件要求较高，不宜普及使用。酶联免疫法虽然灵敏度略逊放射性免疫测定法，但是简单、安全，易于普及，且测量结果与放免结果有较强的相关性[47]。

为达到尽量简便高效、切实可行的目，很多研究人员探索在基础分析方法上进行改进，但并没有一个固定的模式。对尿液和粪便中类固醇激素的提取方法，1999年Matsumuro等采用改进的两步萃取法[48]，李春等对李春旺的方法进行改进，只使用甲醇和石油醚两种有机溶剂提取小熊猫粪便中的类固醇激素，避免了致癌物质二氯甲烷的使用[5]。邓涛等专门总结了免疫分析技术在大熊猫繁殖研究中的应用[49]。张肖等分析总结了动物粪便类固醇激素检测过程中可能影响检测准确性的因素，包括样品的新鲜程度、样品量和保存方法；激素代谢的日节律和季节性变化；动物的年龄、性别和繁殖状况等[50]。

但是，应该看到，尽管研究人员在不断探索更加安全、快捷的方法，对激素含量的检测分析基础还是需要建立在一定的专业实验室条件、一定的分析方法和专门人员的技术要求上的，所需资金投入和维护对目前大多数中国动物园来说并不现实，所以除少数几家单位建立有符合条件的实验室，能够独立开展分析监测工作外，其他国内动物园现阶段已开展的激素分析监测绝大多数都是基于与具备条件的相关机构的合作，或样品直接送到专业激素含量测定第三方机构进行测定。因而，一定程度上加大了操作成本，使之不能成为经常性的日常工作。

3.3 粪尿样本的保存时效

受到样品采集时间、分析条件等限制，采集的新鲜动物尿液或粪便样品一般都需要保存一段时间后才能送到实验室进行集中分析。野生动物新鲜粪便的保存时效因物种和保存条件而异，掌握目标物种的新鲜粪便内激素的保存时效是应用粪尿样类固醇激素分析方法的前提[51-53]。

迄今为止，国内外研究者采用尿液样本测定了大熊猫睾酮、雌二醇、孕酮、皮质醇等类固醇激素，成功探查了圈养大熊猫的繁殖生理状态，对尿液样本的采集和保存，不同研究者使用不同的方法[24]。毕温磊等评估了样品分析量和保存时间对野生大熊猫粪便样品类固醇激素结果的影响，认为在实际应用中，对于非新鲜的大熊猫粪便样品应根据不同检测目的在样品保存的有效期内进行类固醇激素的准确检测[54]。

不同研究者对不同动物物种粪样内类固醇激素时效的认定存在一定的差异。郎冬梅等对圈养林麝(Moschusberezovskii)粪便样品3种保存条件下(不处理、90%甲醇和0.9%抗生素)类固醇激素含量变化做了研究，认为在不能保证冷冻条件的情况下，用90%的甲醇保存对于研究林麝粪便类固醇激素是一种较好的保存方法[55]。陈浩春等利用2只成年雄性和4只成年雌性的尿液样品共21份，确定川金丝猴尿液类固醇的保存时效和保存方法，结果表明：4 ℃时，雄性川金丝猴尿液睾酮、雌性尿液睾酮、孕酮的保存时效为7 d左右；雌性尿液雌二醇的保存时效在3 d以内。-20 ℃时，雄性川金丝猴尿液中睾酮的含量在60 d内保持稳定；雌性尿液中睾酮、孕酮和雌二醇的含量在60 d、45 d、60 d内保持稳定。认为，-20 ℃保存川金丝猴尿液样品是一种有效、可靠的方法[56]。兰天以普氏野马为研究对象，采集5雄5雌共10匹普氏野马粪样，经乙醇浸泡和烘箱干燥法处理后，分别放置0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、20 d、25 d 8个保存时间梯度，采用酶联免疫测定法，分别测定了不同性别、不同保存方法处理的粪便在各个时间梯度的激素含量[10]。林若兰等在应用Cat ELIAS Kit检测华南虎粪样雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黄体生成素时证明具有很好的稳定性，同时试验得到粪样在常温条件下短时间(9 d)保存不影响检测结果[36]。

崔媛媛等通过实验比较各种冷冻法、有机溶剂法和干燥法3类方法的优劣，认为各种保存野生动物粪样的方法均存在利弊，需谨慎选择才能达到试验的要求[57]。故而，样本保存方法、保存条件的差异，保存时间的长短都会影响到分析监测结果，找到一个较适合各家动物园自身条件的保存方法，需要每个实验监测单位多方摸索。

4 可行性对策

4.1 在日常管理中植入科学意识和理念

现代动物园管理是以专业知识和技术为基础，从科学的角度理解、分析和解决饲养实践中的问题。尽管中国动物园行业目前仍处于总体发展不平衡、技术水平相对落后的阶段，但是全面推行科学管理是大势所趋，饲养实践过程必然要从仅依靠日常经验发展到经验与科学分析的紧密结合，对野生动物圈养中的各种问题势必要达到“知其然，知其所以然”，使其科学化、专业化、精细化。

对动物园中大多数动物的繁殖生物学研究，不仅仅要深入开展行为学观察，更要摒弃“条件限制、无法进行”等思想，将科学意识和理念融入管理各环节，理解野生动物实验样本的得来不易和独特性，珍惜日常管理中每一次操作机会，适时取样、留存样本，创造条件获得监测数据。

4.2 充分发挥行业互联互通作用

充分发挥行业协会的联动作用，以《全国动物园发展纲要》中提出的“全面推行科学的物种种群管理”为契机，积极呼吁各级部门对动物园科技投入的支持；从行业协会层面加强横向联系机制的建立，推进国际交流与合作，完善技术培训和人才队伍的培养；调动和发挥大型动物园的示范引领作用。

借助目前正在大力推进的濒危物种种群管理、谱系管理和以地理区域划分的协作片区模式，结合物种种群管理分级名录，选择优先或已具备条件的监测物种，以点带面，让有条件开展生殖监测工作的动物园或相关机构，与相邻片区动物园、饲养机构结对，从技术力量、业务指导乃至具体测定等工作中互联互通。

坚持实施和日积月累，必然成为中国动物园全行业科学管理能力和水平的又一提升，以促进传统动物园转型发展。

4.3 进一步发挥行为训练辅助作用

客观而言，从动物血样中直接测定激素水平是最理想的分析监测手段。基于野生动物福利保障的正向行为训练可以有效降低动物应激水平，确保操作人员和动物的安全，为动物疾病诊断和医疗保健提供便利。通过有效的健康治疗行为训练，很多大熊猫个体已经可以达到在非麻醉条件下，配合饲养人员和兽医进行相关检查，包括静脉采血[58-61]。

现阶段国内动物园中对圈养条件下的其他野生动物基于医疗保健和福利提升的行为训练也正如火如荼地开展，涉及的种类有小熊猫[62]、黑猩猩[63]、红毛猩猩(Pongopygmmaeus)[64]、东北虎[65]、非洲象[66]等。通过这些训练，都在一定程度上实现了动物处于放松状态、无麻醉下的健康体检、医疗注射、腕、尾部静脉穿刺、足部护理等日常管理操作。虽然目前动物园中绝大多数饲养的野生动物仍然还不能达到理想的无损伤采集血样状态，但是在激素监测中行为训练无疑是最值得坚持的辅助手段。