膜铁转运蛋白的缺失对破骨细胞分化的影响

周 剑，王 磊，储 彬

破骨细胞的骨吸收作用和成骨细胞的骨形成作用在骨骼发育、骨量平衡及骨损伤的修复中至关重要[1]。骨骼通过不断地骨重建来实现自身的代谢更新，使骨的吸收与形成处于动态平衡。在大多数骨代谢疾病中，如骨质疏松症、骨Paget's病、牙周病和肿瘤的溶骨性转移，由于破骨细胞数量的增加或活性的增强导致骨吸收过度表达，进而引起病理性骨流失[2]。铁是生物体维持稳态的重要元素，哺乳动物的细胞通过摄取转铁蛋白、亚铁血红素、铁蛋白或通过非转铁蛋白获得铁[3]。在哺乳动物细胞中，由Slc40a1基因编码的膜铁转运蛋(ferroportin, Fpn)是目前唯一确定的能够排出细胞铁的通道蛋白[4]，未利用的细胞铁既可以储存在铁蛋白中，也可以通过Fpn排出。Slc40a1基因的突变会导致常染色体隐性遗传性疾病——血色素沉着症[5]，这是一种铁超负荷类疾病。近期已有学者研究[6]证明，下调Fpn的mRNA表达水平对破骨细胞有重要的影响，为了进一步探讨Fpn在骨髓谱系细胞中的缺失是否影响破骨细胞的分化，该研究建立了基因敲除小鼠模型，在体外观察Fpn在骨髓谱系细胞中的缺失对破骨细胞分化的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料与试剂 本实验小鼠购自美国Jackson实验动物中心;α-MEM细胞培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；鼠重组细胞核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)(美国Peprotech公司)；胰酶细胞消化液(美国Life Technologies公司)；10×青霉素-链霉素-L-谷氨酰胺、牛血清白蛋白、破骨细胞分化标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphase, TRAP)染色试剂盒(美国Sigma公司)；磷酸缓冲盐溶液(美国Diamedix公司)；RNeasy mini试剂盒(美国Qiagen公司)；High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(美国Applied Biosystems/Thermo-Fisher Scientific公司)；TaqMan Universal Master Mix(美国Applied Biosystems公司)；RIPA缓冲液、小鼠抗组织蛋白酶K单克隆抗体、小鼠抗α微管蛋白单克隆抗体(美国MilliporeSigma公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物公司)；小鼠抗NFATc1单克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗PGC-1β多克隆抗体(美国Abcam公司)。

1.1.2仪器 CO2恒温细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；双目显微镜(美国Olympus公司)；光学显微镜(美国Carl Zeiss公司)；Step One Plus荧光定量PCR仪(美国Life Technologies公司)；微量紫外分光光度计(美国Thermo scientific公司)；PCR 扩增仪、微孔检测仪、垂直电泳仪、半干转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1骨髓巨噬细胞及破骨细胞的分离培养 2月龄小鼠用CO2处死后，取双侧股骨及胫骨骨髓，室温下红细胞裂解液裂解5 min，在一个100 mm培养皿内接种5×106个骨髓巨噬细胞(bone marrow macrophages, BMMs)，并加入α-10 MEM和M-CSF，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，隔天换液1次。4～5 d后获得M-CSF依赖性BMMs。

将两种小鼠的BMMs接种于多孔细胞培养板中或培养皿内，同时加入含有M-CSF和RANKL(100 ng/ml)的α-10 MEM诱导其向破骨细胞分化，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，于第2天后每天换液1次并收集细胞，即可获得破骨细胞前体细胞(pre-osteoclasts, pOCs)和成熟的破骨细胞(osteoclasts, OCs)。

1.2.2TRAP染色及阳性细胞计数 如上述细胞培养法，将两种小鼠的BMMs接种于48孔细胞培养板内(塑料组)及含有骨片的48孔细胞培养板内(骨片组)。塑料组分为两组(3 d和4 d)，骨片组只有一组(4 d)。每孔细胞密度为1.5×104个/ml，每种细胞设5个副孔。同时加入M-CSF和RANKL诱导分化，于第3天和第4天从细胞培养箱中取出，4%多聚甲醛固定细胞后，TRAP(一种破骨细胞分化标志物)染色：在含有亚硝酸钠、碱性副品红溶液及萘酚AS-BI磷酸盐的NaK酒石酸盐溶液中36 ℃孵育10～15 min，双蒸水洗3次后风干，光镜下观察。

计数标准：实验组及对照组2组细胞分别在100倍视野下每孔随机选取6个视野进行计数。成熟的破骨细胞呈现大圆片状，粉红或玫瑰红色，细胞核≥3个。上述实验每种细胞6个孔，即重复6次。

1.2.3荧光实时定量PCR 如前所述细胞培养法，将两种小鼠的BMMs培养于6孔细胞培养板中，分为BMMs组、pOCs组及OCs组，每组6个孔(实验组3个孔，对照组3个孔)，BMMs组中仅加入M-CSF，而pOCs组及OCs组中加入M-CSF和RANKL诱导其向破骨细胞分化。每孔细胞密度为15×104个/ml。分别于第2天取出BMMs组及pOCs组和第4天取出OCs组，每孔加入350 μl RLT溶液，收集细胞裂解液。使用RNeasy mini试剂盒提取全RNA，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒将全RNA逆转录为cDNA。以线粒体基因Mrps2作为内参基因，引物从美国Life Technologies公司购买：Acp5(Mm00475698_m1)，NFATc1(Mm00479445_m1)，Ppargc1b(Mm00504720_m1)，Mrps2(Mm03991065_g1)。通过实时荧光定量PCR检测其破骨细胞标记基因Acp5(编码TRAcP)、Nfatc1(编码破骨细胞关键的转录因子NFATc1)和Ppargc1b(编码PGC-1β)中mRNA的表达量。PCR程序参数如下：50 ℃、2 min，95 ℃、 10 min，然后进行40个95 ℃、15 s及60 ℃、18 s的循环。反应完成后进行扩增曲线和熔解曲线分析，基因表达量以检测基因的初始模板量以2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot 如前所述细胞培养法，将两种小鼠的BMMs培养在100 mm培养皿中，分为BMMs组、pOCs组及OCs组，每组2个培养皿(实验组1个，对照组1个)，BMMs组中仅加入M-CSF，而pOCs组及OCs组中加入M-CSF和RANKL诱导其向破骨细胞分化。每个培养皿细胞密度为1.5×106个/ml。分别于第2天取出BMMs组及pOCs组和第4天取出OCs组，经RIPA裂解后，摇床上冰镇30 min，14 000 r/min、4 ℃、离心15 min，提取上清液。再用BCA试剂盒测量蛋白浓度后，按1 ∶4比例加入蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer)，95 ℃煮5 min。SDS-PAGE检测破骨细胞分化过程中的相关蛋白CTSK、NFATc1和PGC-1β的表达。

2 结果

2.1TRAcP染色

2.1.1在细胞培养板上观察 对48孔培养板中的细胞分别于第3天和第4天进行细胞固定，然后行TRAcP染色，通过t检验结果如下：① 在第3天时，对照组中可见大量TRAP染色阳性的小圆细胞，而成熟的破骨细胞TRAP阳性率为8.76%(73/817)，实验组已有部分形成大的多核的TRAP染色阳性的成熟破骨细胞，阳性率为43.17%(376/853)，见图1、表1；② 在第4天时，实验组已有大量TRAcP染色阳性的多核的成熟破骨细胞形成，阳性率为84.75%(700/830)，而对照组仅有部分破骨细胞形成，阳性率为31.32%(249/783)，见图1、表1。

2.1.2在骨片上观察 养在骨片上的细胞在第4天行细胞固定，TRAcP染色后可见实验组已有大量TRAcP染色阳性的多核的成熟破骨细胞形成，而对照组仅有部分破骨细胞形成，见图1。

2.1.3细胞计数 显微镜下对2.1.1实验中细胞培养板中的成熟破骨细胞进行计数，如表1及图2所示，结果如下：① 第3天，实验组中成熟的破骨细胞数为(376±75)个，对照组为(73±32)个，实验组明显高于对照组，差异具有统计学意义(P=0.000 047 51)；② 在第4天，实验组中成熟的破骨细胞数为(700±58)个，对照组为(249±22)个，实验组明显高于对照组，差异具有统计学意义(P=0.000 000 96)。

图1 两组BMMs分别培养在48孔细胞培养板与骨片上并行TRAP染色 ×1 000

A、B：对照组分别于第3天和第4天在培养板上行TRAcP染色；D、 E：实验组分别于第3天及第4天在培养板上行TRAcP染色；C、F：对照组与实验组分别于第4天在骨片上行TRAcP染色

表1 TRAP染色的计数结果

图2 对TRAP染色阳性的成熟破骨细胞的计数与对照组比较：***P<0.001

2.2实时荧光定量PCRRT-PCR检测实验组与对照组中BMMs、pOCs及OCs三组细胞中的破骨细胞标记基因Acp5(编码TRAP)、Ctsk、NFATc1(编码破骨细胞关键的转录因子NFATc1)和Ppargc1b(编码PGC-1β)的mRNA相对表达量，RT-PCR结果显示：① 在实验组及对照组中，随着破骨细胞分化的逐渐成熟，其相关基因的mRNA表达量逐渐增加；② 在pOCs组及OCs组，实验组Acp5、Ctsk、NFATc1的mRNA的表达量均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；③ 在OCs组，实验组Ppargc1b的mRNA表达水平高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；④ 虽然在pOCs组中，实验组与对照组之间Ppargc1b的mRNA表达量差异无统计学意义，但实验组Ppargc1b的mRNA表达水平仍高于对照组，见图3、表2。

表2 RT-PCR检测破骨细胞分化过程中标记基因mRMA表达量的P值

2.3Westernblot检测实验组与对照组中BMMs组，pOCs组及OCs组三组细胞的CTSK、NFATc1和PGC-1β蛋白表达量，结果如下：① 在BMMs组中，实验组与对照组的CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白表达量均极低，说明基本上不表达CTSK、NFATc1、PGC-1β蛋白；② 在pOCs组，实验组三种蛋白的表达量已开始高于对照组；③ 但在OCs组，实验组中仅NFATc1及PGC-1β的蛋白表达量明显高于对照组，见图4。

图3 RT-PCR检测破骨细胞标记基因的mRNA的表达水平

A：Acp5(编码TRAcP)中mRNA的表达水平；B： Ctsk中mRNA的表达水平；C： Ppargc1b(编码PGC-1β)中mRNA的表达水平；D：Nfatc1(编码破骨细胞关键的转录因子NFATc1)中mRNA的表达水平

图4 通过Western blot检测破骨细胞分化过程中相关蛋白的表达水平

A: 用tubulin作为内参，检测CTSK(1 μg/μl)蛋白的表达水平; B: 用tubulin作为内参，检测NFATc1(1 μg/μl)和PGC-1β(1 μg/μl)蛋白的表达水平; m:巨噬细胞；p:破骨细胞前体细胞；oc:成熟的破骨细胞

3 讨论

Fpn也被称为Slc40a1，在2000年由Donovan et al[7]首先发现，并发表于Nature杂志。目前已经证明Fpn是哺乳动物细胞内排出铁的唯一通道蛋白[4]，并有大量的研究[8]证明其在铁代谢平衡中具有重要作用。人的Fpn基因定位在2号染色体上，长度20 bp，并有8个外显子，其mRNA的5'末端非翻译区含有一个典型的铁反应元件IRE[7]。Fpn mRNA编码的蛋白有570个氨基酸，分子量约62 ku，至少有10个跨膜结构域，是一种膜蛋白。Fpn蛋白在哺乳动物里是一种高度保守的蛋白，人、小鼠、大鼠的序列同源性有 90%～95%[9]。因此，本研究的动物模型选择小鼠。Fpn蛋白广泛分布在哺乳动物的十二指肠、胎盘、肝、肾、肌肉、肺、脑等，参与这些器官的铁代谢[10]。

研究[6]证明，下调Fpn的mRNA表达水平对破骨细胞有重要的影响。但本课题组通过下调多种基因表达并研究显示，基本都对破骨细胞的分化存在影响[11-12]，故认为这种阳性结果不一定准确。另外，有研究[13]证明，Fpn的种系缺失会导致小鼠胚胎致死。因此，本研究通过在骨髓谱系细胞中特异性敲除Fpn基因，建立了一种全新的基因敲除小鼠模型。取其骨髓巨噬细胞进行细胞培养，并加入RANKL及M-CSF(破骨细胞分化过程中两种极其重要的细胞因子)诱导其向破骨细胞分化，在显微镜下可观察到Fpn基因敲除的小鼠骨髓巨噬细胞加速形成成熟的破骨细胞，并通过细胞固定，TRAP染色，计数等方法进一步证实了Fpn的缺失对破骨细胞的形成分化有着显著的促进作用。

为了明确Fpn的缺失在分子水平上如何影响破骨细胞的形成分化，本研究通过荧光实时定量PCR检测了几种破骨细胞标志物，结果显示随着破骨细胞的形成分化，其标志物显著增加，其中Acp5、Ctsk、NFATc1这几种标志物明显高于阴性对照组，Ppargc1b mRNA的表达量虽然在破骨细胞前体细胞阶段升高不具有显著性，但在成熟破骨细胞阶段其表达量显著增加。这些结果表明Fpn的缺失可能诱导破骨细胞分化形成过程中的多种细胞因子的活化，进而促进骨髓巨噬细胞分化形成成熟的破骨细胞。

本研究又通过Western blot检测CTSK、NFATc1及PGC-1β的蛋白含量，进一步证实了RT-PCR结果的可靠性。NFATc1和PGC-1β(两种对破骨细胞分化至关重要的转录因子)的蛋白含量随着破骨细胞的分化逐渐增加，并明显高于阴性对照组。然而，CTSK似乎在破骨细胞分化成熟阶段并没有显著升高，这与之前RT-PCR定量Ctsk分析P=0.046相比较，其实并没有多大矛盾。首先RT-PCR表明Ctsk确实升高，但是相比较其他几种标志物来说增高并不明显。其次，破骨细胞在分化形成的过程中，调控的通路并不只有一条，也就是说并不一定每一种标记物都显著增高，因此本实验Western blot结果具有可靠性。

综上所述，本研究揭示了在骨髓谱系细胞中敲除Fpn会促进破骨细胞分化形成。至于其是否会进一步对骨量造成影响，以及对成骨细胞是否有正反馈或负反馈作用，对铁量的聚集是否有刺激作用，进而引起铁代谢性疾病，还有待进一步的研究。