MKP-1在PTSD样大鼠海马组织中表达改变

邢文龙，刘超猛，王梅子，朱志慧， 张桂青

创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD)是经历异乎寻常的灾难性创伤事件所造成，以延迟出现和持续存在为特点的身心障碍。在最新出版的DSM-5中将核心症状修改为：与创伤事件有关的创伤性体验重现、持续性回避与创伤事件有关的刺激、认知与心境方面消极改变和警觉性增高或反应性明显改变，在创伤后开始出现或加重[1]，但其发病机制复杂，产生各种表现的具体机制需要进一步的研究。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)是一种双特异性蛋白磷酸酶，可以使苏氨酸或酪氨酸残基去磷酸化，负向调控MAPK信号通路，从而参与了神经元及突触可塑性、神经元功能和存活等方面的调节[2]。同时，近期也有研究显示，MKP-1在抑郁中是一种负性调节蛋白，在抑郁模型的大鼠海马组织中明显上升[3]，而且通过注射升高海马组织中的MKP-1后，大鼠会出现抑郁样行为[4]。然而在PTSD患者中也会出现认知与心境等方面的消极表现，这是否也与海马组织中的MKP-1的表达有关。该实验旨在研究PTSD样大鼠海马组织MKP-1 mRNA及蛋白表达与大鼠的行为学改变和认知改变之间的关系，以进一步探讨PTSD的发生机制。

1 材料与方法

1.1实验动物30只健康清洁级雄性SD大鼠，体质量(180±20)g，由新疆疾病控制动物中心提供。实验动物的喂养严格按照石河子大学动物饲养规定，光照时间控制在12/12 h ，温度(21±2)℃，适应环境7 d。

1.2主要试剂山羊多克隆抗MKP-1抗体(英国abcam公司)；兔抗山羊二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen公司)；cDNA合成试剂盒(美国Thermo-fermentas 公司)。

1.3模型制备按照随机数表法将SD大鼠分为Control组、PTSD 1 d组、PTSD 3 d组、PTSD 7 d组、PTSD 14 d组(每组n=6)。PTSD组均采用2005年日本文部省召开的国际PTSD科学会议确定的SPS模型[5]进行造模,依次通过连续束缚2 h、强迫游泳、乙醚麻醉3个步骤进行模型制备，造模完成后7 d内尽量避免打扰。

1.4旷场实验于造模后第8、10、14、21天,分别对PTSD 1 d组、PTSD 3 d组、PTSD 7 d组、PTSD 14 d组和Control同一时间段进行旷场试验。旷场箱为(900 mm×900 mm×500 mm)，箱底部划分25个16 mm×16 mm格子，将其置于安静的环境中，避免光线直射，通过红外摄像机，记录大鼠5 min的运动轨迹，水平得分(也称为自主运动)，定义为大鼠水平穿越的方格数，规定大鼠3个或4个爪进入同一记为1分；垂直得分(也称为探索行为)，定义为以2个后爪支撑身体，2个前爪离开底面，每离开一次就记为1分[6]。通过观察大鼠的站立次数、跨格次数评判大鼠的行为学指标。

1.5水迷宫实验分别于9、11、15、22 d对PTSD 1 d组、PTSD 3 d组、PTSD 7 d组、PTSD 14 d组和Control组进行连续5 d的Morris水迷宫实验测量各组的空间探索能力；在实验后的第6 天撤掉Morris水迷宫水下站台，测定大鼠的空间记忆能力。

1.6定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠海马组织MKP-1的mRNA水平① 分别于刺激后第15、17、21和28 天，将SD大鼠麻醉后采用断头取脑，取出大鼠大脑，迅速剥离获取海马组织；② 用TRIzol 法提取海马组织的总RNA，采用紫外分光光度计(Thermo NanoDrop 2000)测量总RNA的浓度与纯度，当260 nm/280 nm在 1.8～2.0范围内时，按照cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录；③ MKP-1基因引物设计、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物序列为：上游引物：5’-AAGATATGCTCGACGCCTTG-3’,下游引物：5’-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3’；β-actin上游引物：5’-CAACCTTCTTGCAGCTCCTC-3’，下游引物：5’-CGGTGTCCCTTCTGAGTGTT-3’；④ 采用荧光定量PCR试剂盒在64孔 ABI Prism7300 序列检测系统 (美国应用生物系统公司)进行扩增。内参基因与目的基因各重复3次，同时设3个阴性对照，建立总体积为20 μl的反应体系，反应条件为：95 ℃，2 min(1个循环)；95 ℃，5 s ；60 ℃， 30 s(40个循环)，循环结束后得到扩增曲线；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，30 s；60 ℃，15 s后得到溶解曲线。

1.7Westernblot法检测MKP-1的蛋白表达取大鼠海马，用研钵研碎，研磨之前用液氮冷却研钵，在研磨过程中同时滴加液氮，充分研磨后加RIPA裂解液，提取出总蛋白。采用紫外分光光度计测量总蛋白的浓度，配平后取20 μg蛋白上样，通过12%的SDS-PAGE胶电泳，电转到PVDF膜，用血清封闭2 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃摇床孵育16 h。TBST溶液洗膜后，上二抗(1 ∶10 000)常温孵育1 h，TBST再次冲洗后移至暗室进行显影。蛋白表达通过条带的灰度值表示。

2 结果

2.1旷场实验进格次数和直立次数比较PTSD 1 d组、PTSD 3 d组与Control组相比在进格次数和直立次数中差异无统计学意义(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d组与Control组相比，进格次数减少，直立次数下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2水迷宫定位航行能力比较大鼠在应激后分别于9、11、14、21 d行连续5 d的水迷宫实验，在第1～3天,PTSD 1 d、PTSD 3 d、PTSD 7 d、PTSD 14 d组与Control组相比上台潜伏时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；在4、5 d，与PTSD 1 d、PTSD 3 d组与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d组与Control组相比潜伏期时间缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3水迷宫空间探索能力比较在水迷宫实验的第6天行空间探索能力比较，穿台潜伏期和穿台次数与Control组比较，PTSD 1 d、PTSD 3 d组差异无统计学意义(P>0.05)，PTSD 7 d、PTSD 14 d组与Control组相比所需时间延长，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4大鼠海马组织MKP-1mRNA水平表达PTSD 1 d(0.81±0.17)、PTSD 3 d(1.06±0.39)组与Control组(0.67±0.08)相比大鼠大脑海马组织的MKP-1 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)，PTSD 7 d(2.61±0.65)、PTSD 14 d(2.54±0.76)组与Control组相比MKP-1 mRNA的表达升高，且差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5大鼠海马组织MKP-1蛋白水平表达Western blot 的实验结果显示，PTSD 7 d组、PTSD 14 d组MKP-1蛋白表达较Control组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表1 旷场实验直立次数和进格次数比较

与Control组比较：*P<0.05

表2 水迷宫实验

与Control组比较：*P<0.05

图1 大鼠海马组织MKP-1的表达

1：Control组；2：PTSD 1 d组；3：PTSD 3 d组；4 ：PTSD 7 d组；5：PTSD 14 d组；与Control组比较：*P<0.05

3 讨论

PTSD是一种发病机制不清、病情复杂多变，治疗效果不理想的一种心身障碍疾病，起初是在战争后的士兵中发现的，也成为“战争疲劳”，经过对该疾病的进一步认识，发现经历严重威胁个体生命的事件如恐怖袭击、暴力犯罪和虐待、军事战斗、自然灾害、严重事故等创伤性或危及生命的事件后，也会出现类似表现。根据美国PTSD中心统计的数据来看，在美国PTSD的终生患病率为5%,女性多于男性，女性的患病率约为男性的两倍，其中PTSD患者中将有30%的人会有长期伴随症状[7]。然而近年来，错综复杂的原因引起自然灾害与人为灾难频繁发生，这些突发事件对人体生理上的损害可能会在一定时间内痊愈，但是会对人们造成严重而持久的心理创伤。因此PTSD越来越成为社会关注的重点[1]，也成为精神病学、心身医学和临床心理学的研究重点。SPS刺激制造PTSD样大鼠模型是目前国际公认的最高仿真模型，已广泛应用于PTSD机制的研究。在本研究结果中，给予大鼠SPS刺激后PTSD 7 d组、PTSD 14 d组的旷场试验结果提示大鼠在经受应激后紧张度增高，自主行为减少，探索欲望下降，在Morris水迷宫实验结果中显示大鼠空间探索以及定位定航能力均出现下降的情况，这两个结果提示大鼠在行为、记忆方面出现改变，这与典型的PTSD样症状的特征相吻合[8]。表明本实验SPS刺激制作创伤后应激障碍模型是可靠的。

MKP-1属于促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases,MKPs)家族，通过去磷酸化作用负向调控MAPK(p38、ERK1/2、JUN)的信号通路，在神经细胞的生长、分化、增殖、凋亡中有着重要作用[9]。Comalada et al[10]研究发现，MKP-1在神经系统的调节中起着重要作用，参与神经系统的中的认知、学习、神经元发育等多个方面。有研究表明，MKP-1使JNK信号传导通路失活，引起微管结构不稳定，从而影响神经元的轴突发育[11-12]，也可通过磷酸化和泛素化对ERK信号转导通路进行控制，影响海马组织轴突的可塑性和长时程增强作用(long-term potentiation，LTP)，而LTP是巩固记忆的重要机制[13]。也有研究[14-15]显示 MKP-1 表达上调会通过负向调控 MAPK 信号，引起 NO 生成减少造成脑血流灌注不足，加重脑组织损伤，导致脑神经元细胞凋亡。然而目前国内对MKP-1在PTSD方面研究的报道较少。本实验从不同时间点对MKP-1进行检测，研究结果显示，PTSD 1 d组、PTSD 3 d组中MKP-1 mRNA以及蛋白表达并无明显改变，而在PTSD 7 d组与PTSD 14 d组的MKP-1 mRNA以及蛋白表达高于Control组，这说明SD大鼠在受到SPS刺激后海马组织中的MKP-1水平是动态波动的，出现的紧张度增高，自主行为减少，学习记忆能力下降等症状也可能与MKP-1水平升高有关。本研究中全部选用雄性SD大鼠，主要是避免雌性鼠在其性周期中因雌激素水平变化对MKP-1的表达产生影响，从而造成结果不准确。