中华鳖Foxl2基因克隆及外源性激素对其表达的影响

高丽丽 刁晓明 李 云 翟旭亮 周春龙

(1. 西南大学动物科技学院, 重庆三峡生态渔业产业技术研究院, 重庆 400715; 2. 西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室, 重庆 400715; 3. 重庆市水产技术推广站, 重庆 400020)

Foxl2(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉头状转录因子超家族(Forkhead transcriptionfactor,FOX)成员之一[1,2], 1993年被发现, 主要在垂体和卵巢颗粒细胞中表达, 通过转录调节其目的靶基因的转录、蛋白表达, 参与颗粒细胞的增殖与分化, 与卵巢发育性二态分化和卵巢功能维持密切相关[2—4]。Foxl2突变引起小睑裂综合征(BPES)、卵巢早衰(POF)、肿瘤及山羊的无角间性综合征(PIS)[4—6]。迄今Foxl2基因已在许多脊椎动物和部分无脊椎动物中获得, 且结构高度保守。Foxl2在哺乳动物中研究最为深入, 被认为是雌性相关基因[4,6]。国外学者对许多龟鳖动物的Foxl2基因进行了较为详细的研究[7,8], 但对于中华鳖Foxl2基因的相关研究未见文献报道。

中华鳖(Pelodiscus sinensis)隶属于爬行纲、龟鳖目、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus), 之前温度依赖型性别决定模式已被公认, 但总有20%—30%的个体并没有沿温度方向发育, 遗传因素是影响其性别发育方向的重要方面[9]。对于爬行动物, 关键基因除外, 性激素在一定程度调控性别分化[10,11], 且在不同的发育阶段发挥不同的作用[12]。

本实验室克隆了Foxl2 cDNA部分序列, 并以10 mg/kg剂量的MT和E2对中华鳖成鳖进行注射实验, 通过分析Foxl2表达变化, 旨在生理水平显示外源性激素处理后Foxl2的响应模式, 以分析激素与性别相关基因的关系, 为中华鳖性别调控机制提供一定的生物学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年5月22日, 从重庆市北碚区歇马镇星云养殖场购买150只中华鳖, 体长为(12.01±2.01) cm,体宽为(11.20±1.20) cm, 体重为(291.80±103.80) g,置于室内淡水循环养殖池中暂养3d, 水源为曝气自来水, 水温为(26±0.5)℃。共分为5个组。

1.2 试剂

17α-甲基睾酮(MT)和17β-雌二醇(E2)购自生工生物工程(上海)股份有限公司, Trizol试剂以及pMD18-T Vector购自Takara, IScriptTMcDNA Synthesis Kit以及SsoFast Eva Green购自Bio-Rad,GoTaq(R)Green MasterMix和BM5000 DNA Marker购自Promega, 其余国产分析纯试剂, 购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 实验设计

在本实验开展的前期, 已经研究了中华鳖Foxl2多种组织的时空表达, 结果表现出典型的性别二态性, 卵巢表达量明显高于精巢表达量(结果待发表),在此研究工作的基础上, 以同一浓度激素分别注射雌性与雄性个体, 充分显示E2和MT对中华鳖成鳖Foxl2基因表达的影响。

在驯养3d后, 剔除体弱或受伤个体, 测量体型参数, 注射激素后放入对应编号养殖池。1号池为对照组, 2、3、4、5号池为实验组。剂量为10 mg/kg,每组设3个重复, 每个重复10只, 实验周期15d。注射后的0、6h、12h、24h、48h、7d和14d时间点随机抽取实验个体, 以0为对照组, 并取出卵巢和精巢组织置于液氮中保存备用, 后转入-80℃冰箱保存,以备总RNA提取。

1.4 总RNA提取与cDNA合成

上述采集到的组织样品用研钵在液氮中充分研磨, 取100 mg左右的研磨干粉, 根据Trizol(TakaRa)一步法提取各组织样品总RNA, 所得到的总RNA定量到1 μg。通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳, Goldview染色, 检测RNA的完整性。将所有样品的总RNA用微量核酸测定仪(NanoDrop 1000)测定其浓度和纯度, 确保OD值在1.8—2.0。根据IScriptTMcDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)试剂盒合成cDNA, 得到的cDNA -20℃保存备用。

1.5 基因克隆和序列分析

根据Ensembl网站预测的中华鳖Foxl2基因mRNA序列, 针对于Foxl2基因的保守区域, 利用Primer Premier 5.0软件来设计兼并引物, 用于后续实验过程中的同源克隆。设计好的引物序列由华大基因公司合成; 所涉及的引物如下:Foxl2 (F: 5′-ATGATGGCCAGCTACCAGG-3′, R: 5′-CTAGATG TCTATCCGGGAGTGC-3′); GAPDH (F: 5′-AGAA CATCATTCCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCA CCTTCTTAATGTCGTC-3′, GenBank登录号:AB 124567.1)。引物均稀释为10 μmol/L备用。

以卵巢组织的总RNA进行反转录生成第一链cDNA, 并将该cDNA作为模板, 使用Foxl2的上、下游引物, 对该目的基因进行PCR扩增。PCR体系为25 μL, 扩增条件: 94℃ 5min; 35个循环(94℃ 40s,60℃ 40s); 72℃ 5min。PCR扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳、切胶并回收纯化后连接到pMD18-T载体上, 转化DH5α大肠杆菌, 培养过夜, PCR筛选阳性克隆后经测序获得Foxl2基因片段。

根据NCBI网站的氨基酸序列BLAST分析, 选取一部分典型的脊椎动物物种, 经Mega5.0软件的Neighbor-joining法构建各物种Foxl2氨基酸序列的系统进化树, 比较中华鳖Foxl2基因与其他物种之间的亲缘关系。用DNAMAN软件对不同物种的Foxl2基因所编码的氨基酸序列进行多重比对。

1.6 引物设计及荧光定量PCR

定量PCR引物设计跨越内含子以减少基因组DNA的影响, 各引物序列如下:Foxl2 (F: 5′-AGAA CAGCATCCGCCACA-3′, R: 5′-GGGTCCAGCG TCCAGTAGTT-3′); GAPDH (F: 5′-AGAACATCATT CCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCACCTTCTT AATGTCGTC-3′)。

从性腺提取总RNA, 按照IScriptTMcDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)试剂盒合成cDNA, 以合成的20 μL cDNA为模板, 使用SsoFast Eva Green (Bio-RAD公司)荧光定量试剂盒。按照以下参数配置10 μL体系: SsoFast EvaGreen supermix 5 μL, 上下游引物各0.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3 μL, 反应液的配制在冰上操作, 每个反应3次重复, 各个样品做3次平行实验, 按以下参数在CFX-96实时荧光定量扩增仪进行PCR扩增: 95预变性30s; (95℃, 5s;60.2℃, 30s), 40个循环。为了保证PCR扩增和检测的特异性(是否含有二聚体), 每个PCR反应的程序后都增加溶解曲线, 65—95℃, 5s/0.5℃。

1.7 数据分析

目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法, 2-ΔΔCt值代表目的基因与对照组表达量之间的倍数差异。目的基因表达量的统计值用算数平均值±标准误(mean±SE)表示, 用SPSS17.0软件进行单因素方差(One-Way ANOVA)和Tukey B检验法统计分析。以P＜0.05作为显著性差异;P＜0.01为非常显著性差异;P＜0.001为极显著差异。

2 结果

2.1 中华鳖Foxl2基因部分cDNA克隆

以卵巢组织cDNA为模板进行PCR, 产物电泳显示一条约为903 bp的片段, 随后经华大基因公司测序, 经NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列比对, 确定为中华鳖Foxl2基因片段, 编码大约300个氨基酸残基。将该序列提交GenBank, 已获得登录号: KP734210。

根据NCBI网站的氨基酸序列BLAST程序进行中华鳖Foxl2基因与其他物种同源关系分析, 结果表明: 中华鳖与红耳龟(Trachemys scripta)相似性最高, 达到99%; 西部锦龟(Chrysemys picta bellii)、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、红原鸡(Gallus gallus)次之, 分别为92%、88%和84%, 其他物种的相似性基本在66%—80%。通过DNAMAN软件进行多重序列比对显示Foxl2具有高度保守的FH结构域(图 1A)。构建系统进化树表明: 中华鳖Foxl2与同目爬行动物聚为一分支, 其中与西部锦龟遗传距离最近(图 1B)。

2.2 E2对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响

如图 2所示, 处理6h后雌性个体中Foxl2的表达量高于对照组, 差异不显著(P＞0.05), 12h和24h后,E2极显著上调雌性个体Foxl2的表达量(P＜0.001),其表达量呈现与时间相关的增加趋势, 分别增加到对照组的8倍和18倍, 尤其在24h出现表达高峰, 至第48h和第7天时雌性个体Foxl2的表达量下降, 差异不显著(P＞0.05); 至14d后E2又显著提升Foxl2的表达量(P＜0.05), 达到对照组的5倍; 处理6h、24h和48h后雄性个体Foxl2的表达量低于对照组, 差异不显著(P＞0.05), 至7d之前, E2对雄性个体Foxl2的表达影响均不显著(P＞0.05), 至7d和14d后, E2极显著上调Foxl2的表达量(P＜0.001), 均增加到对照组的5倍。

结果显示: 1 mg/mL E2明显促进雌性中华鳖Foxl2的表达, 促进高峰在24h, 随着时间的推移其促进作用呈现减弱的趋势; 1 mg/mL E2在注射后期促进雄性中华鳖Foxl2的表达, 其促进高峰时间比雌性个体大大延迟, 表达高峰出现在7d和14d, 且其表达量整体要低于在雌性个体中的表达量。

2.3 MT对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响

如图 3所示, 处理6h和12h后雌性个体中Foxl2的表达量高于对照组, 差异不显著(P＞0.05);至24h之前, MT对雌性个体Foxl2的表达影响不显著(P＞0.05), 随着时间的延长; 至24h后, MT极显著上调雌性个体中Foxl2的表达(P＜0.001), 出现表达高峰, 达到对照组的17倍; 至第48h、第7和第14天后,Foxl2的表达量呈现显著下降的趋势(P＜0.05),但均稳定在高于注射前5倍的水平。处理6h和12h后雄性个体Foxl2的表达量与对照组持平, 差异不显著(P＞0.05); 随着注射时间的延长, 尤其在24h,MT极显著促进Foxl2的表达(P＜0.001), 出现表达高峰, 达到对照组的5倍; 第48h后, 其表达量低于对照组(P＞0.05); 7d后,Foxl2的表达量又出现显著回升的趋势(P＜0.05); 至14d后, 其表达量略微下降。

结果显示: 1 mg/mL MT明显促进雌性中华鳖Foxl2的表达; 除48h外, 1 mg/mL MT对雄性中华鳖Foxl2的表达呈现不同程度的促进作用, 但其作用没有雌性明显, 且无论雌雄, 24h时MT的促进作用最强。

3 讨论

3.1 中华鳖Foxl2基因序列分析

多重序列比对显示中华鳖Foxl2基因部分片段含有一个高度保守的FH结构域, 且与其他很多物种具有很高的相似性, 说明该结构域在不同物种生长发育过程中发挥重要作用; 同源性分析表明, 中华鳖Foxl2基因是已发现物种Foxl2基因的同源基因, 该基因在进化上具有较高的序列保守性和功能一致性; 其中与红耳龟和西部锦龟的同源性分别达到99%和92%, 说明其在进化上与爬行类的同源性;聚类分析表明中华鳖与西部锦龟的Foxl2基因在同一大支, 而与氨基酸同源性较高的红耳龟的Foxl2基因亲缘关系较远, 这说明Foxl2基因在进化过程中承受了不同的选择压力, 最终导致不同物种之间该基因的进化速率差异, 但是其在进化过程中变异还是较小, 且保守性很高, 其演化关系也与生物学结果一致。

3.2 E2对中华鳖Foxl2基因表达的影响

图 1 Foxl2氨基酸序列比对及分子进化树分析Fig. 1 Comparing amino acid sequence alignments and phylogenetic analysis of Foxl2

图 2 E2对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响Fig. 2 The effects of E2 on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

图 3 MT对雌雄中华鳖Foxl2基因表达的影响Fig. 3 The effects of MT on the Foxl2 expression in Pelodiscus sinensis's females and males

在非哺乳脊椎动物中, 雌激素是卵巢分化的关键因素, 但其作用机制仍不甚了解。本研究结果显示, E2促进中华鳖Foxl2基因的表达, 雌性的促进作用比雄性明显, 且其表达高峰时间比雄性提前(提前一周), 可以判断E2以不同的途径调控中华鳖雌雄个体中Foxl2基因表达。目前国内外对中华鳖Foxl2基因的研究尚少见报道。多数文献报道雌激素促进Foxl2的表达[13,14]; 降低雌激素合成或者抑制雌激素信号转导均可显著抑制Foxl2的表达[15,16],如南方鲇(Southern catfish)[17]、虹鳟(Rainbow trout)[18]、鸡(Gallus gallus)[19]以及稀有 鲫(Gobiocypris rarus)[20]; 关于其调控机制, 有学者解释为Foxl2基因通过激活芳香化酶(雄激素转化为雌激素的关键酶)的表达, 从而共同调控雌激素的生成[21,22];哺乳动物中也有类似现象[23]; 本研究中雌性的表达结果与以上研究结果一致。雌激素信号传导过程依赖于细胞环境和受体的存在, 即雌激素受体(ERα和ERβ)以及跨膜受体GPER(非基因组通路),基因组通路(ERα和ER)的表达水平可以发生转换,这种转换允许E2在不同的方向介导其作用并调节未成熟支持细胞的增殖[24]。正常雌性个体中雌激素受体及其相应原件均处于非激活状态。从本研究结果来看E2可能通过激活雌性个体中的ERα或者ERβ来启动相应原件(在基因转录水平上)上调Foxl2的表达, 当细胞内激素浓度发生改变, 则开始调动GPER来调节激素平衡。但是我们并没有检测内源激素水平和性腺发育状态, 所以不能进行验证,而且雌激素的具体作用机制比较复杂, 这也是我们后续的研究热点。

最新研究报道, 雌激素在动物雄性个体中同样发挥重要作用, 其中雌激素介导的ERα信号对于生殖细胞活性和维持生精上皮的正常组织至关重要。雌激素的生理水平对精子生成至关重要, 高剂量对精子发生有损伤作用, 而低剂量则对其有积极作用[24]。Hultman等[25]也发现EE2处理雄性虹鳟后,Foxl2表达水平上升。中华鳖雄性个体中Foxl2的表达水平在E2暴露7d后明显上升, 这说明E2在雄性中华鳖生长后期发挥了重要作用, 但是对于具体机制,尚不清晰, 还需进一步研究。

3.3 MT对中华鳖Foxl2基因表达的影响

中华鳖雌雄个体注射MT后,Foxl2基因表达增强, 在24h时均出现表达高峰, 之后逐渐减弱, 其变化趋势可能与体内外源MT有效剂量的变化相关,表明中华鳖雌雄个体以相同的节奏和强度应答外源MT, 24h是Foxl2基因应激MT的敏感时期, 且MT对雌性个体的作用比雄性强烈。

有文献报道MT在鱼类等性逆转过程中发挥重要作用[26,27]; Fenseke和Segner[28]用10000 ng/L剂量的MT处理斑马鱼, 结果发现CYP19b表达量上升。雄激素的信号传导过程主要依赖以下3个途径: 直接与雄激素受体(AR)结合、或者在芳香化酶的作用下转化为雌二醇, 随后雌二醇与雌激素受体结合而发挥效应, 也可以转化为二氢睾酮(DHT)。本研究结果表明Foxl2基因的表达依赖以上机制的相互作用。MT影响雌雄个体的高峰期一致, 也说明MT促进中华鳖Foxl2基因表达的性别差异较小, 但是以上机制之间的具体作用机理及如何切换我们目前还不清楚。而且MT是直接作用于Foxl2基因还是通过间接的激素平衡反馈机制, 我们也不得而知。我们推测MT暴露不久后, MT转化为了内源性的E2, 雌雄性个体的应答机制间接转为拟雌激素效应, 并通过干扰内源性激素的合成及代谢而发挥作用。此外还有研究表明MT抑制Foxl2基因的表达[29], 这可能由于多种因素导致, 例如所使用的性激素化合物种类不用; 所采用方法的不同; 注射时间和浓度的差异; 或者是实验动物所处的不用发育或生理时期等因素造成的。相关研究表明, 使用外源雄激素和芳香化酶抑制剂后, 血清中E2水平下调[30—32], 但是我们没有检测中华鳖血清内激素含量的变化, 所以无法进行验证, 这也是本文的不足之处。

总之, 基因在信号通道和代谢2个水平产生重要影响, 前者具有迅速而猛烈的特性, 后者具有缓冲和补偿功能。在中华鳖雌性个体中, 外源性激素是以影响信号通道为主的模式来调控Foxl2表达;在雄性个体中, 外源性激素打破了中华鳖原有激素的平衡[29], 改变了原有的代谢模式, 逐渐切入信号通道。从我们的实验中, 可以得出中华鳖雌性个体中Foxl2基因对外源性激素的应答模式趋于一致,而中华鳖雄性个体中Foxl2基因对外源性激素的应答模式存在差异, E2和MT均促进中华鳖Foxl2基因的表达。但是不能分析其具体机制及E2对雄性个体中Foxl2基因的持续作用, 希望在后续的研究中得到结果。