电针联合甲强龙对椎间盘脱出大鼠的有效性和安全性研究

张荣，纪婷，饶宇腾，姜代勋，李佳，陈武*

(1.北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)2. 宠福鑫中西结合国际动物诊疗中心，北京102206)

甲泼尼龙琥珀酸钠(methylprednisolone sodium succinate，MPSS，甲强龙)作为一种强效的甾体类抗炎药，常被用于临床治疗急性脊髓损伤性炎症。但是，对其在椎间盘脱出治疗中的有效性见解不一，对损伤超过8 h的有效性多为否定意见[1-2]。我们在兽医临床通过大量的案例观察到，电针联合甲强龙对犬的椎间盘脱出疗效显著，即使发病超过48 h甚至一周以上的患犬的恢复过程也明显快于单独使用甲强龙或单独电针组。针灸的基本作用原理是调动调节机体固有机能，电针是否通过某种机制与甲强龙产生协同作用需要进一步研究。为此，本试验以大鼠为模型，观察了电针联合甲强龙组(EA+MP)，单独电针组(EA)和甲强龙组(MP)对运动机能、脊髓神经细胞尼氏小体的影响和副作用的发生率等，以期为临床运用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD大鼠112只，雌雄不限，体重(200±20)g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，饲养于北京农学院动科楼九层屏障环境中【SYXK(京)2015-0004】，保证供给实验动物充足的饮水与食物,环境温度(24±2)℃，湿度50%～70%。本实验得到北京农学院动物伦理委员会许可(伦理审查批准编号:2012-0611)。

1.1.2 主要试剂及仪器设备

显微镊(上海金钟手术器械厂，WT3080)；自制硅胶垫片(长4 mm、宽2 mm、厚1 mm， 取材于6Fr无菌双腔导尿管，CREATE MEDIC CO．，LTD.，日本)；电针仪(北京欣东华电子仪器有限公司，WQ-6F)；针灸针(苏州天协针灸器械有限公司，0.2 mm×25 mm)；组织脱水机(上海徕卡仪器有限公司，EG1150H)；石蜡包埋机(上海徕卡仪器有限公司，EG1160)；石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2235)；展片机(天津天利航空机电有限公司，ZPJ-1 A)；倒置荧光显微镜(Olympus，RE-3000)；多赖处理防脱片(北京中杉金桥生物技术有限公司，17010501)；尼氏染液(上海碧云天生物技术有限公司，C0117)；戊巴比妥钠(Sigma，57-33-0)；无水乙醇(北京化工厂，20170216)；二甲苯(北京化工厂，20170216)；中性树胶(上海标本模型厂，规格：100 g/瓶)。

1.2 方法

1.2.1 分组

大鼠常规饲养适应1周后开始试验， 随机分为分别为假手术Sham组(20只)、模型Model组(20只)、甲强龙MP组(24只)，电针EA组(24只)，电针联合甲强龙EA+MP组(24只)。各组按取样时间点分4个亚组。

1.2.2 模型制备及穴位选取

大鼠椎间盘模型参照卢知松等的方法制作[3]。腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)，胸腰结合处背正中线部位剃毛、消毒，背侧做2 cm切口切开第一腰椎(L1)至第二腰椎(L2)处，钝性分离肌肉组织，剥离背最长肌和多裂肌，至完全暴露L1与L2之间相连接的关节突，用咬骨钳于L1和L2椎间孔避开神经根及血管，分别向前向后各咬掉L1及L2侧椎板的1/2，暴露脊髓。Model组、MP组、EA组和EA+MP组大鼠用自制硅胶片 (4 mm×2 mm×1 mm)填塞入胸腰椎结合部脊髓腹侧，Sham组不填塞，生理盐水冲洗创口并清理残留血液，切口逐层常规缝合。术后按分组分笼饲养，完全清醒后不做任何处理饲养24 h后进行Basso、Beattie and Bresnahan(BBB)评分，BBB评分压迫侧后肢介于0-2分、对侧后肢介于0-10分者，纳入实验，随机分组，评分不符合实验要求者做淘汰处理，数量不足组进行补齐。

EA组及EA+MP组进行电针治疗所选穴位：左右膀胱俞；左右足三里、趾间。分别接电针仪，连续波，频率2 Hz、输出以每只大鼠所能耐受最大强度为准，每天1次20 min，至取样时间进行取样。

1.2.3 处理方法

各组大鼠造模后常规饲养24 h开始相应处理，记为实验第0天。

(1)Sham组

仅暴露脊髓，不填塞垫片，术后常规饲养，不做任何处理。

(2)Model组

暴露脊髓并填塞垫片，造成椎间盘脱出大鼠模型，压迫程度符合实验要求者入组，常规饲养不做任何处理。

(3)EA+MP组

暴露脊髓并填塞垫片，造成椎间盘脱出大鼠模型，压迫程度符合实验要求者入组，于实验第0天开始先电针20 min，后给甲强龙按30 mg/kg剂量腹腔注射给药，实验第1天仍先电针20 min后再次给药，第2天开始每日仅针灸；

(4)EA组

暴露脊髓并填塞垫片，造成椎间盘脱出大鼠模型，压迫程度符合实验要求者入组，于实验第0天开始，每日针灸1次，每次电针20 min。

(5)MP组

暴露脊髓并填塞垫片，造成椎间盘脱出大鼠模型，压迫程度符合实验要求者入组，于实验第0天开始，按NASCISⅢ所述给药方案[4]，采用30 mg/kg腹腔注射，1～48 h内选取4个时间点按5.4 mg/(kg·h)药量腹腔注射给药。

1.2.4 实验大鼠BBB评分

对大鼠实施造模手术24 h后，采用BBB评分法[5]对大鼠双后肢运动情况进行观察与评价。实验过程中保证同一名实验员每天采用大鼠BBB运动机能评分方法，于实验开始第0天对大鼠左、右后肢分别评分。BBB评分总分21分，得分越高运动机能越好。

1.2.5 实验大鼠脊髓神经元病理变化观察

各组大鼠于相应时间点(实验第1、3、7、14天)腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)，呈U 型剪开胸部，暴露心脏、剪破左心房，主动脉弓处插入0.7×25 TWLB静脉输液针，0.9%生理盐水快速灌注直至肝脏发白。于冰盒上快速剪下脊髓压迫部位，正中向头0.3 cm用于尼氏染色，置于4%多聚甲醛缓冲液中固定后4℃冰箱备用，向尾侧0.5 cm置于-80℃冰冻保存用于其他检测。用于尼氏染色段脊髓经脱水、透明、透蜡、包埋、切片及烘干等步骤制备石蜡切片，层厚5 μm。常规切片脱蜡至水，尼氏染液室温下染色3～10 min，取出切片，蒸馏水快速冲洗后常规脱水、透明、封片，显微镜下观察脊髓神经元尼氏小体，并于400倍镜下拍照。

1.2.6 大鼠活跃度及安全性观察

每日安排同一位观察人员对各组大鼠的活跃度及体况进行观察、评分。

对大鼠的活跃度进行评分(1-4分)，评分标准为：1分：大鼠萎靡、蜷缩、对外界环境反应弱、进食进水减少；2分：大鼠不爱运动、进食进水正常；3分：大鼠机警、主动进食进水、偶尔活动；4分：大鼠活泼、爬笼子玩耍、互相打闹。

对大鼠体况进行观察记录：观察、记录大鼠是否出现如血尿、抽搐等异常症状，并对其发生率进行计算。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠BBB运动功能评分

BBB评分结果如图1，术后各时间点，Model组大鼠运动功能评分均显著降低，与Sham组比较差异有显著性(P< 0.05)。治疗3、7、14 d时间点，MP组、EA组、EA+MP组大鼠左右后肢肢体运动功能评分均有所升高。

对左后肢(压迫侧)BBB评分数据进行分析：EA+MP组3、7 d时与EA组、MP组比较差异有显著性(P< 0.05)。EA+MP组7、14 d时与Sham组水平接近(P> 0.05)；MP组、EA组14 d时与Sham组水平接近(P> 0.05)；Model组在全部时间点均与Sham组相比差异有显著性(P< 0.05)。EA+MP组与EA组在3、7、14 d时与Model组比较差异有显著性(P< 0.05)；MP组在7、14 d时与Model组比较差异有显著性(P< 0.05)。

对右后肢(非压迫侧)BBB评分数据进行分析：EA+MP组3、7 d时与MP组比较差异有显著性(P< 0.05)。EA+MP组、EA组在3、7、14 d时与Sham组水平接近(P> 0.05)；MP组在14 d时与Sham组水平接近(P> 0.05)；Model组各时间点与Sham组比较均差异有显著性(P< 0.05)。EA+MP组、MP组在1、3、7、14 d时与Model组相比差异有显著性(P< 0.05)；EA组在3、7、14 d时与Model组相比差异有显著性(P< 0.05)。

以上结果表明，三组治疗组均能不同程度改善椎间盘脱出发生24 h后大鼠的肢体运动功能，其中电针联合甲强龙组在起效时间及改善程度上均优于甲强龙组及电针组。(见图1)

2.2 尼氏染色观察各组大鼠脊髓组织神经细胞变化结果

染色结果显示：Sham组(图2-E)神经元形态正常，尼氏小体数量较多，着色均匀，胞体呈蓝紫色染色。1 d的Model组(图2-A1)神经细胞数量减少，胞体皱缩，细胞结构受损，部分细胞和周围尼氏小体破碎消失；EA+MP组(图2-B1)、EA组(图2-C1)、MP组(图2-D1)均有部分神经细胞肿胀破碎，尼氏小体消失，其中EA+MP组相比其他各组损伤程度最轻，损伤的神经细胞数量较少，仍保留较多形态结构正常的神经元细胞；3 d的Model组(图2-A2)神经细胞损坏明显，细胞核周边尼氏小体破碎消失，细胞质染色不明显；EA+MP组(图2-B2)相比其他各组保留的正常神经元细胞最多；EA组(图2-C2)及MP组(图2-D2)细胞形态略好于Model组(图2-A2)，EA组可见神经元胞体肿胀、尼氏小体空泡化、细胞质染色变浅；MP组神经元胞体萎缩，尼氏小体数量减少，细胞质染色变浅；7 d的Model组(图2-A3)可见损伤区神经元大量坏死，胞体肿胀、出现空泡样细胞，尼氏染色较浅，视野内可见胶质细胞增生；EA+MP组(图2-B3)神经元数量增加，少有细胞破损，部分尼氏小体减少，细胞质深染；EA组(图2-C3)及MP组(图2-D3)正常神经元数量、尼氏小体染色深度均优于3 d时，仍有部分神经元胞体肿胀破损，尼氏小体染色深度均介于模型组与电针联合甲强龙组之间，二者间甲强龙组神经元形态较好；14 d时，除Model组(图2-A4)神经细胞损坏严重，尼氏小体破碎消失染色变浅之外，其他各组正常神经元数量虽仍少于Sham组(图2-E)，但均有不同程度增加，其中EA+MP组(图2-B4)神经细胞形态较正常，尼氏小体数量明显增多，且核仁、尼氏小体清晰可见，着色均匀。

可见，椎间盘脱出24 h后给予电针联合甲强龙治疗、电针治疗或甲强龙治疗均可不同程度降低神经细胞损伤、防止细胞肿胀、尼氏小体破碎消失，其中电针联合甲强龙疗法效果最佳，能够较好的改善神经细胞形态，增加尼氏小体数量，进而提高神经细胞功能活性。见图2。

2.3 安全性及活跃度观察

对各组大鼠的安全性进行观察记录：甲强龙组出现副作用大鼠共9只，其中3只出现血尿(未死亡)、6只不明原因死亡，部分死亡前抽搐，最终甲强龙组一共消耗30只，副作用发生率30%，死亡率20%；电针联合甲强龙组1只出现血尿(未死亡)，副作用发生率4.16%，死亡率0；电针组副作用发生率0，死亡率0。

对各组大鼠活跃度进行观察评分：电针联合甲强龙组3.8分，电针组3.6分，甲强龙组1.5分。甲强龙组存活大鼠整体消瘦，精神状态一般，安静；另外两组针灸大鼠整体状态活跃，体态丰满，恢复行走的大鼠，大多有打闹、爬笼子等行为，表明电针治疗或电针联合甲强龙治疗可降低其不适感，有效改善椎间盘脱出大鼠生活质量，且副作用发生率相比甲强龙组明显降低。

3 讨论

椎间盘脱出致病的本质是从纤维环脱出到椎管的髓核压迫脊髓造成的急性脊髓损伤。急性脊髓损伤包括原发性和继发性损伤两个主要阶段。直接损伤作用于神经元和神经胶质细胞的同时也造成缺血、缺氧等继发性，引发一系列的生化级联反应导致组织损伤范围不断扩大[6-7]，同时发生邻近神经元和胶质细胞凋亡、坏死。所以在发生椎间盘脱出后，如何有效减缓原发性和继发性损伤是治疗的关键。

注：与Sham组比较，a P< 0.05；与Model组比较，△P< 0.05；与EA+MP组比较，#P< 0.05。图1 各组大鼠左后肢、右后肢运动功能评分比较Note. Compared with the Sham group, a P<0.05. Compared with the Model group, △P<0.05. Compared with EA+MP group, #P<0.05.Figure 1 Motor function scores of left and right hindlimbs in the rat models of intervertebral disc extrusion

注：A．Model组，B．EA+MP组，C．EA组，D．MP组，E．Sham组；1．1 d时间点，2．3 d时间点，3．7 d时间点， 4．14 d时间点。图2 各组大鼠脊髓组织神经细胞变化(Nissl染色，× 40)Note. A. Model group, B. EA+MP group, C. EA group, D. MP group, E. Sham group. 1. 1 d, 2. 3 d, 3. 7 d, 4. 14 d.Figure 2 Using Nissl staining to observe Nissl bodies of each group (×40)

甲强龙(MPSS)被认为具有改善神经传导兴奋、促进脊髓血液循环、减少脂质过氧化反应、稳定细胞膜通道、促进钙离子外流、抑制伤后儿茶酚胺水平增高，抑制损伤局部白细胞介素类物质释放，从而达到减缓脊髓水肿、炎症反应的效果[8-9]，因此在脊髓损伤的治疗中广受期待。美国急性脊髓损伤研究会(NASCIS)给出了使用甲强龙的推荐标准[4,10-11]，但其有效作用时间规定为损伤8 h内，且需注意引起的副作用。大量文献记载MPSS的使用可能增加感染风险[2,4,10-12]，相似的情况也发生在动物上，多项研究还表明使用糖皮质激素的患犬出现胃肠道出血和溃疡的风险较高[13-14]，而兽医临床上大量的病例多在发病1 d后，甚至几天后才会就诊，给甲强龙的使用带来极大的困惑。

然而，我们在临床中对经过核磁确诊的44例椎间盘脱出引起的1-5级瘫痪犬，采用了以电针为主，早期结合甲强龙短时间的冲击疗法(先电针20 min后即刻，30 mg/kg,1 h内静注，连用2 d)，其中41例患犬在2周内不同程度恢复行走，该数据表明，电针联合甲强龙方法对于恢复IVDD患犬行走能力的有效率超过93%，显示了极高的临床价值。

犬椎间盘脱出属“痿症”的范畴，脊髓气血的不足或气滞血瘀是该病的基本病理[15-16]，针灸疗法理应最为对症。我们之前的研究通过临床病例和动物模型证明电针治疗可在压迫持续存在下改善脊髓的血液循环[3]，恢复临床患犬和模型犬的神经机能和运动机能，并长期保持稳定[17]，说明解除脊髓压迫并非治疗椎间盘脱出导致瘫痪的必须条件。这些动物试验的结果，无可辩驳地证明针灸疗效的客观性，而绝不是所谓的主观性“心理安慰”作用； 这点在本研究的大鼠运动机能的BBB评分也得到再次证明(图1)。

尼氏小体为神经元胞体或树突内大的嗜碱性团块和颗粒，是神经元合成蛋白质的主要场所。尼氏小体大而数量多，表明神经细胞合成蛋白质功能较强。本研究观察到 EA+MP组尼氏小体的形态和数量显著优于对照组，且甲强龙的副作用发生率仅为4.16%。提示电针联合甲强龙具有增强保护神经细胞形态、增加尼氏小体数量，进而改善肢体运动机能，且有效降低甲强龙副作用发生率，提高动物生存质量的功效。这一作用，可能与电针迅速改善脱出模型受压脊髓的微循环，增强损伤局部甲强龙的输送与疗效的发挥有关。

本研究表明，对椎间盘脱出超过8 h(即超过甲强龙最佳治疗时间窗)后的病例，采用电针联合甲强龙进行治疗为有效治疗方案，建议临床参考使用。