利用Illumina MiSeq测序平台分析野生树鼩粪便微生物多样性

张飞燕，金洁，马玉华，王芸，张庆宇，赵玲，邬继文，吕龙宝,2*

(1. 中国科学院昆明动物研究所， 昆明 650000； 2. 中国科学院昆明灵长类研究中心， 昆明 650223)

随着生物医学、药学及生命科学的诸多研究领域发展，灵长类动物模型是跨越基础和临床研究之间所必需的、有时甚至是唯一的桥梁。目前，临床前新药评估因缺乏灵长类动物疾病模型验证而导致失败率极高，因此，发达国家医学界均在致力于解决这一关键问题。树鼩作为新型实验动物，通常被认为是低等的灵长类动物，具有鲜明的特色，值得科研工作者推广[1]。树鼩自身具有的独特特点，如体型小、繁殖周期短、饲养成本低，具有比高等灵长类动物更适合大规模应用的优势，如各种类型的病毒性肝炎、流感病毒、轮状病毒、细菌、寄生虫感染及糖尿病、肿瘤等人类疾病的动物模型在树鼩身上的成功研究，树鼩将会成为与灵长类动物一样的实验动物[2]，其树鼩实验动物化、资源推广对研究人类疾病及新药研发具有极其重要的价值。这意味制定出完善的树鼩携带微生物的国家标准迫在眉睫。虽然已有2012 年云南省发布的树鼩地方标准，但还缺乏对树鼩肠道菌群的系统性研究报道。特别是对野生树鼩肠道微生物的携带情况缺乏系统研究[3]，目前有的研究也是主要采用的是传统的培养技术，以及以克隆 /测序为主要手段的分子生物学技术，缺乏有关野生树鼩肠道细菌的高通量测序研究[4-7]。因此，作为野生树鼩的实验动物化过程中，微生物检测很重要。本试验旨在应用高通量测序技术研究野生树鼩细菌结构与组成，为进一步开发利用这一新型实验动物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

3只10～12月龄的雄性野生树鼩捕捉于云南昆明西郊野外，体重100～110 g，捕捉后饲养于中国科学院昆明灵长类中心普通级环境【SCXK(滇)K2017-003】，动物实验在中国科学院昆明灵长类研究中心进行【SYXK(滇)K2017-0008】，无菌操作采取粪便，编号Y1 Y2 Y3，迅速放到液氮罐中，带回实验室-80℃冰箱。

1.1.2 主要试剂和仪器

TransStart Fastpfu DNA Polymerase；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司); PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型。

1.2 方法

1.2.1 细菌总DNA提取

使用omega ezna试剂盒，按照说明书步骤抽提细菌基因组。基因组DNA抽提完成后，琼脂糖凝胶电泳和核酸检测仪检测总DNA质量。

1.2.2 PCR扩增

针对16sRNA的V3-V4区(338F-806R)，合成特异性引物。 每个样本设置3个重复，PCR扩增，PCR扩增产物混合后，脂糖凝胶电泳检测产物质量。PCR产物质量合格后，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司)切胶回收PCR产物，琼脂糖电泳检测质量。

1.2.3 荧光定量

利用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)定量检测PCR产物，检测PCR产物的均一化。

1.2.4 Miseq文库构建及测

通过PCR链接“Y”字形接头，去除自连片段，PCR扩增进行文库模板富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。测序工作在美吉生物完成。

1.3 统计学方法

测序后的数据进行统计优化分析，OTU聚类分析，计算Chao指数、Ace指数、Sobs指数和覆盖指数(Coverage)等多样性指数。每个样本都做了稀释性曲线和Shannon指数曲线。并从各个分类水平上进行物种组成分析及16 s功能预测。

2 结果

2.1 粪便基因组DNA提取

粪便DNA提取后，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000核酸检测仪检测DNA的纯度、浓度和完整性。三个样本的浓度(> 7 μg)，OD260/280的比值在1.8-2.0之间，表提取的示DNA基因组的浓度和纯度都比较高，无杂质污染；从电泳图看出样本无杂带，完整性较好，均满足后续PCR和测序要求(图1)。

注：M：DL 1Kb； 1-3：野生树鼩粪便样品。图1 DNA电泳检测图Note. M: DL 1 Kb; 1-3: wild tree shrew fecal samples.Figure 1 Results of DNA electrophoresis

2.2 测序水平

本研究利用Illumina MiSeq测序平台对3个树鼩粪便样本的V3-V4区进行测序研究，测序数据经过优化分析， 共得到181 657 条有效序列，平均每个样本有(60 552±3897)条序列，其中样本获得序列数最高与最低相差8370 条；通过对测序数据按97%的相似水平进行聚类分析，共获得624个OTU，平均每个样本(208±21)个OTU。样本OTUs 含量最高与最低相差52 个。

2.3 α多样性指数的分析

基于OUT聚类分析结果，对OUT进行Alpha多样性分析，树鼩大肠埃希菌的chao指数是229，Shannon指数是3.19，simpson指数为0.09，通过Shannon 稀释曲线分析(图2)，曲线趋近平缓，并且覆盖度Good’s coverage达到99.97%，两者共同说明了对所取样本微生物群落的检测比率接近饱和，目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种。

2.4 聚类分析

基于Unweighted UniFrac距离，对所有样本进行聚类分析(图3)，结果表明，根据样本层级聚类分析结果，Y2样本与Y3样本聚到一起，Y1与Y2、Y3分开，表示Y1样品与Y2、Y3的组成差异较大。

图2 shannon 指数稀释曲线Figure 2 Shannon rarefaction curves

图3 样本层级聚类分析Figure 3 Hierarchical clustering tree on OTU level

2.5 物种组成分析

本研究野生组树鼩肠道细菌鉴定出有9个门、17个纲、31个目、56个科、124个属和172个种。

2.5.1 在门水平上的菌群组成

在门水平上，物种组成分析共获得9个门，细菌(Bacteria)：99.07%，为微生物群落的主要组成部分，只有极小一部分微生物(0.93%)未被鉴定到。相对丰度大于1%的有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、 螺旋体门(Spirochaetae)，这5个菌门占到总体群落的99.01%。其余相对丰度小于1%的各菌门为梭杆菌门(Fusobacteria)、柔膜菌门(Tenericutes)脱铁杆菌门(Deferribacteres)和Saccharibacteria门(图4)。

2.5.2 在纲水平上的菌群组成

在纲水平上，共获得17个纲。丰度最高的为芽孢杆菌纲(Bacilli)和拟杆菌纲(Bacteroidia)，其次丰度大于1%的纲还有梭菌纲(Clostridia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、厌氧菌纲(Negativicutes)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)、放线菌纲(Actinobacteria)和螺旋体纲(Spirochaetes)(图5)。

图4 门水平上的菌群组成Figure 4 Community analysis pie chart at phylum level

2.5.3 在目水平上的菌群组成

在目水平上，共获得31目，乳杆菌目(Lactobacillales)和拟杆菌目(Bacteroidales)的丰度最高。其次丰度大于1%的有梭菌目(Clostridiales)、芽孢杆菌目(Bacillales)、Selenomonadales目、假单胞菌目(Pseudomonadales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)、螺旋体目(Spirochaetales)(图6)。

图5 纲水平上的菌群组成Figure 5 Community analysis pie chart at class level

2.5.4 在科水平上的菌群组成

在科水平上，共获得56个科，链球菌科(Streptococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)所占的丰度最高，。其次丰度大于1%的有拟杆菌科(Bacteroidaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、 乳杆菌科(Lactobacillaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)和消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)(图7)。

2.5.5 在属水平上的菌群组成

图6 目水平上的菌群组成Figure 6 Community analysis pie chart at order level

图7 科水平上的菌群组成Figure 7 Community analysis pie chart at family level

图8 属水平上的菌群组成Figure 8 Community analysis pie chart at genus level

在属水平上，124个属中，23个属(1.7%)，尚未被注释出具体菌属名。相对丰度大于1%的菌属被定义为优势菌属，共有15属。优势菌群乳球菌属(Lactoccus)、链球菌属(Streptococcus)、普雷沃菌属(Prevotella9)、拟杆菌属(Bacteroides)、魏斯氏菌属(Weissella)、库特氏菌属(Kurthia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、Faecalibacterium属 、Blautia属、丛毛单胞菌属(Comamonas)、肠球菌属(Enterococcus)、Peptoclostridium属、短小芽孢杆菌属(Lysinibacillus)。通结果分析 分析发现有益细菌乳球菌属(Lactoccus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度相对较高，而乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度较低0.04%，这3种菌在所检测样本中都含有(图8)。

2.6 16 s功能预测分析

通过COG功能分类统计，微生物主要的COG功能包括： 氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、DNA重组修复、核苷酸转运与代谢、能量生产与转换、辅酶转运与代谢、脂质转运与代谢、无机离子转运与代谢核糖体生物合成(图9)，该分析结果表明，树鼩样本中的微生物代谢功能非常丰富。

图9 COG功能分类Figure 9 COG functional classification

3 讨论

本试验利用Illumina MiSeq测序技术，对16sRNA的V3-V4进行扩增研究树鼩粪便菌群组成及多样性。与传统分离培养方法相比克服了野生树鼩肠道不可培养细菌的难题，同时高通量测序能全面检测样品，数据量大、测序快速。本试验的Shannon 稀释曲线分析表明本试验的覆盖度(Good’s coverage)达到99.97%，说明了对所取样本微生物群落的检测比率接近饱和，目前的测序量能够覆盖样本中的绝大部分物种。邢进等[8]利用细菌分离培养、分子克隆鉴定技术从野生树鼩粪便中分离得到16个科、32个属、56种细菌。本试验分离得到9个门、17个纲、31个目、56个科、124个属和172个种，较真实全面的反映了树鼩肠道菌群的组成情况。3只健康野生树鼩微生物的种类和数量不完全相同，推测可能由于3只野生树鼩的饮食差异，本身的状况差异等因素造成的。研究表明，肠道微生物的种类和数量与所处环境和饮食有关。但高通量测序技术也存在不足，虽然会得到大量数据，但后续数据处理费时费力[9]；对于小范围测序所用的费用相对较高[10]

通过物种组成分析可，发现含量相对较高的是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门，这三种门占据到96.01%。邢进等发现厚壁菌门的鸡葡萄球菌和变形菌门的埃希氏菌是野生树鼩的主要寄生菌群，与我们检测到的优势门相似。赵晗旭[11]等研究表明厚壁菌门为野生动物肠道内的优势菌群，也这与本次研究的结果一致。在目水平优势菌群主要为乳杆菌目(Lactobacillales)和拟杆菌目(Bacteroidales)。 在科水平上，共获得56个科，链球菌科(Streptococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)所占的丰度最高。在属水平上，乳酸乳球菌属和链球菌属的丰度最高。在科、属的水平与邢进、刘丽君等[12]的研究报道有所差异。在属的水平上，发现乳酸乳球菌是一种有益的益生菌，定植在动物胃肠道起防病保护宿主健康的作用。 另外益生菌如乳酸杆菌属和双歧杆菌属在树鼩肠道中也发挥着重要的作用。乳酸杆菌和双气杆菌具有调节肠道微生态平衡，改善营养等功能[13-15]。本研究这两种益生菌都在树鼩粪便中检测，但丰度不高，都小于1%。针对双歧杆菌属和乳酸杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度较低，可以深入研究添加双歧杆菌、乳酸杆菌的添加剂饲料，来调节树鼩肠道疾病。

肠道微生物对宿主的生理，能量代谢起重要作用，并影响免疫系统等多种作用[16-17]。大量研究表明人类疾病与肠道菌群的失调有关，例如炎性肠炎(IBD)、肥胖、糖尿病、心脏病等疾病[18-20]。由此可见，肠道微生物对人的生理作用具有一定的影响。因此，本研究通过16sRNA预测功能分析发现树鼩粪便中的绝大部分细菌与转运代谢功能有关。破坏正常菌群的结构可能会对这些代谢通路产生阻碍。同时也发现还有一大部分功能未知，也是未来的一个研究方向。这可能与树鼩特定的生物学特性有关。其他如辅酶转运与代谢、蛋白修饰等功能，也表明肠道菌群发挥着重要的作用。