寻常型银屑病患者脂肪间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调控作用

尹秀平，朱榕嘉，庄 晨，王 烁，赵春华，宋 坪

1中国中医科学院广安门医院皮肤科，北京 100053 2中国医学科学院基础医学研究所组织工程研究中心 干细胞新药研发及临床转化研究北京市重点实验室，北京 100005 3漳州市中医院针灸科，福建漳州 363000

脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，AMSCs)是一种来源于脂肪组织的成体间充质干细胞，具有一定的免疫调节作用，在免疫治疗方面具有广阔的应用前景。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs) 能够对T淋巴细胞产生免疫调控作用，可以抑制促炎性T淋巴细胞的活化、增殖和分化成熟以及改变免疫细胞分泌的细胞因子，使其倾向于抗炎和免疫耐受功能，也可以促进抑制炎症反应的T淋巴细胞的优势分化，以帮助机体恢复免疫平衡[1]。以T淋巴细胞亚群介导的免疫功能紊乱在寻常型银屑病的发生和发展过程中发挥关键作用，近年研究显示辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)和调节性T细胞(regulatory cells,Treg)两种不同的T细胞亚群在银屑病发生过程中发挥重要作用[2-3]。目前，有文献报道，寻常型银屑病患者骨髓和皮肤MSC对T淋巴细胞的免疫调控作用减弱[4-5]，而笔者在前期研究中发现寻常型银屑病患者AMSCs表达及分泌免疫抑炎因子和促炎因子的能力减弱，可能对T淋巴细胞的免疫调控功能减弱[6]。因此，本研究以寻常型银屑病患者AMSCs和外周血淋巴细胞为研究对象，采用AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养方式，探讨患者AMSCs对外周血Treg和Th17细胞亚群比例的作用，以及对这两种T细胞亚群免疫功能的影响，以期探索寻常型银屑病T淋巴细胞免疫紊乱的发生机制，为临床治疗寻常型银屑病提供理论基础。

资料和方法

资料标本来源：(1)脂肪间充质干细胞：收集寻常型银屑病患者3 例，均经中国中医科学院广安门医院临床检查确诊为寻常型银屑病，年龄 15～65 岁，病程6个月～10 年，选取健康志愿者3 名作为对照组。脂肪组织标本均采自腹部脂肪，经北京协和医院整形外科进行抽脂手术获取。所有患者取材前均征得本人同意，并签署知情同意书。(2)外周血淋巴细胞：2016年5月至2017年2月在中国中医科学院广安门医院皮肤科就诊的进展期寻常型银屑病患者4例，年龄15～65 岁，病程6个月～10 年。纳入标准：就诊前1个月未系统使用过生物制剂及免疫抑制剂，包括维甲酸类药物和免疫抑制剂等。排除标准：①患有其他自身免疫性疾病以及其他重大疾病。②合并其他内、外科疾病。

AMSCs的分离、培养采集患者和正常人脂肪组织各50 ml，提取AMSCs，培养于AMSCs专用培养基，传代培养至第3(P3)代备用。

外周血淋巴细胞的分离、培养用抗凝管采集患者外周血10 ml，淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞待用。

细胞培养AMSCs 与患者外周血淋巴细胞共培养：设置患者外周血淋巴细胞单独培养组、患者AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组、健康人AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组，将培养至P3的 AMSCs 铺板，待细胞完全贴壁后，将外周血淋巴细胞种植于预先铺有 AMSCs的6孔板中，外周血淋巴细胞∶AMSCs比例为 10∶1，于PMI1640培养液[内含10%胎牛血清、双抗、白介素-2(interleukin-2，IL-2)]中培养，37 ℃，5% CO2，混合培养 48 h后待测。

Th17和Treg细胞所占比例检测收集AMSCs 与患者外周血淋巴细胞共培养体系中外周血淋巴细胞，按照Th17和Treg 细胞试剂盒(达科为生物技术股份有限公司)中说明书进行操作，用流式细胞仪检测Th17和Treg 细胞所占比例，CFlow软件分析。

实时荧光定量PCR检测Trizol 法提取总RNA，反转录合成cDNA，按实时荧光定量 PCR试剂盒中说明书操作，在 PCR仪上进行实时定量检测[cDNA合成相关试剂、实时荧光定量 PCR试剂盒等由宝生物工程(大连)有限公司提供]。对实验结果采用 2-[△△ct]的方法进行分析。

酶联免疫吸附实验检测细胞因子的表达收集AMSCs 与患者外周血淋巴细胞共培养中上清液，按照酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒(莱兹生物科技有限公司)中说明书进行操作，在酶标仪上检测 450 nm处吸光度值，计算标本浓度。

统计学处理所有数据均采用SPSS 16.0统计学软件进行分析处理，计量资料以均数±标准差表示,组间比较符合正态分布者采用方差分析，不符合正态分布者采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

患者AMSCs对外周血Treg细胞的增殖作用AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养2 d后，采用流式细胞术分别检测各培养组中Treg细胞比例，结果显示，单培养外周血淋巴细胞组Treg细胞占总淋巴细胞的比例为(1.0±0.1)%，健康人AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Treg细胞占总淋巴细胞的比例为(3.2±0.5)%，患者AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Treg细胞占总淋巴细胞的比例为(1.3±0.2)%，与外周血淋巴细胞单培养组比较，健康人AMSCs促进Treg细胞增殖，差异具有统计学意义(P=0.001)，患者AMSCs有促进Treg细胞增殖的趋势，但差异无统计学意义(P=0.485)。与健康人AMSCs相比，患者AMSCs促进Treg细胞增殖的作用明显减弱(P=0.001)(图1)。

患者AMSCs对外周血Th17细胞的抑制作用AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养2 d后，采用流式细胞术分别检测各培养组中Th17细胞比例，结果显示，单培养外周血淋巴细胞组Th17细胞占总淋巴细胞的比例为(1.1±0.1)%，健康人AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Th17细胞占总淋巴细胞的比例为(0.8±0.3)%，患者AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Th17细胞占总淋巴细胞的比例为(0.8±0.3)%，与外周血淋巴细胞单培养组比较，患者AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组和健康人AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Th17细胞比例具有下降趋势，但差异均无统计学意义，且患者AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组Th17细胞比例与健康人AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养组比较差异无统计学意义(图2)。

Treg:调节性T细胞；PBL：外周血淋巴细胞；AMSCs：脂肪间充质干细胞；PE：藻红蛋白；Foxp3:叉头转录因子3

Treg:regulatory cells；PBL：peripheral blood lymphocyte；AMSCs：adipose mesenchymal stem cells；PE：phycoerythrin；Foxp3:transcription factor forkhead box p3

A.PBL单培养组；B.患者AMSCs+PBL共培养组;C.健康人AMSCs+PBL共培养组

A.PBL culture alone group；B.psoriasis AMSCs+PBL co-culture group;C.healthy people AMSCs+PBL co-culture group

图1流式细胞术检测外周血Treg细胞占CD4细胞比例

Fig1Proportion of Treg cells in CD4+cells by flow cytometry

Th17:辅助性T细胞17；IL：白细胞介素；APC：别藻青蛋白；SSC-A：侧向角散射-A

Th17:T helper cell 17；IL：interleukin；APC：allophycocyanin；SSC-A：side scatter-A

A.PBL单培养组；B.患者AMSCs+PBL共培养组;C.健康人AMSCs+PBL共培养组

A.PBL culture alone group；B.psoriasis AMSCs+PBL co-culture group;C.healthy people AMSCs+PBL co-culture group

图2流式细胞术检测Th17细胞占CD4细胞比例

Fig2Proportion of Th17 cells in CD4+cells by flow cytometry

患者AMSCs对外周血淋巴细胞抑炎相关因子的促进作用AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养2 d后，采用实时荧光定量PCR和ELISA检测各培养组外周血淋巴细胞表达和分泌抑炎细胞因子IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)及Treg细胞关键转录因子Foxp3情况，实时荧光定量PCR结果显示：健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组中抑炎细胞因子IL-10、TGF-β及转录因子Foxp3的mRNA与外周血淋巴细胞单培养组相比较呈高表达，差异有统计学意义(P=0.03，P=0.00，P=0.02)；患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组中IL-10、TGF-β、Foxp3的mRNA表达与与外周血淋巴细胞单培养组比较有升高趋势，但差异无统计学意义；患者AMSCs对外周血淋巴细胞表达TGF-β及转录因子Foxp3 mRNA的促进作用比健康人AMSCs明显减弱，差异有统计学意义(P=0.00，P=0.03)，对外周血淋巴细胞IL-10 mRNA的表达有促进趋势，但差异无统计学意义(P=0.09)(表1)。同时，ELISA检测结果显示，患者与健康人AMSCs分泌的IL-10分别为(0.4±0.1)ng/μl、(0.5±0.1)ng/μl,分泌TGF-β分别为(573.5±70.0)ng/μl、(786.3±274.8)ng/μl。与外周血淋巴细胞单培养组淋巴细胞分泌的IL-10、TGF-β水平比较，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组淋巴细胞分泌的抑炎细胞因子IL-10水平有上升趋势，但差异无统计学意义(P=0.54)，TGF-β水平上升(P=0.00)；与健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组比较，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组淋巴细胞分泌抑炎细胞因子IL-10、TGF-β的能力有下降趋势，但差异无统计学意义(P=0.07，P=0.16)(表1)。

患者AMSCs对外周血淋巴细胞促炎相关因子的抑制作用AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养2 d后，采用实时荧光定量PCR和ELISA检测各培养组中外周血淋巴细胞表达和分泌促炎细胞因子IL-17、IL-23及Th17的关键转录因子维A酸相关孤独受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,RORγt)情况，实时荧光定量PCR结果显示，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组促炎因子IL-17、IL-23的mRNA和健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组IL-17、IL-23的mRNA与外周血淋巴细胞单培养组比较差异无统计学意义，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组RORγt的mRNA和健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组RORγt的mRNA与外周血淋巴细胞单培养组比较呈低表达(P=0.00)；与健康人相比，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组促炎细胞因子IL-17、IL-23及转录因子RORγt的mRNA水平无变化(表2)。同时，ELISA检测结果显示，患者和健康人不分泌IL-17，分泌IL-23分别为(2.9±0.4)ng/μl、(6.1±4.2)ng/μl。与外周血淋巴细胞单培养组淋巴细胞分泌的IL-23、IL-17水平比较，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组促炎细胞因子IL-23和健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组IL-23水平具有下降趋势，但差异无统计学意义，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组IL-17水平无变化，健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组IL-17水平具有下降趋势，但差异无统计学意义；与健康人比较，患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组外周血淋巴细胞分泌的促炎细胞因子IL-23、IL-17水平差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表 1 qRT-PCR和ELISA检测AMSCs对外周血淋巴细胞抑炎相关因子表达和分泌的影响Table 1 Effect of AMSCs on expression and secretion of anti-inflammatory cytokines in peripheral blood lymphocytes by qRT-PCR and

qRT-PCR：实时荧光定量聚合酶链式反应；ELISA：酶联免疫吸附剂测定法；TGF-β:转化生长因子-β；P1：患者AMSCs+PBL共培养组与PBL单培养组比较；P2：健康人AMSCs+PBL共培养组与PBL单培养组比较；P3：患者与健康人AMSCs+PBL共培养组比较

qRT-PCR：quantitative real-time polymerase chain reaction；ELISA：enzyme-linked immunosorbent assay；TGL-β:transforming growth factor-β；P1：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P2：healthy people AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P3：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with healthy people AMSCs+PBL co-culture group

表 2 qRT-PCR 和ELISA检测AMSCs对外周血淋巴细胞促炎相关因子表达和分泌的影响Table 2 Effect of AMSCs on expression and secretion of pro-inflammatory related factors in peripheral blood lymphocytes by qRT-PCR 和

RORγt:维A酸相关孤独受体γt；P1：患者AMSCs+PBL共培养组与PBL单培养组比较；P2：健康人AMSCs+PBL共培养组与PBL单培养组比较；P3：患者与健康人AMSCs+PBL共培养组比较

RORγt:retinoid-related orphan nuclear receptor γt;P1：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P2：healthy people AMSCs+PBL co-culture group compared with PBL culture alone group；P3：psoriasis AMSCs+PBL co-culture group compared with healthy people AMSCs+PBL co-culture group

讨 论

寻常型银屑病是一种慢性、炎症性、免疫性皮肤病，其病理机制错综复杂，目前普遍认为，寻常型银屑病的发病机制与免疫紊乱密切相关，目前对其的研究聚焦于Th17、Treg及二者分泌的众多细胞因子。Th17 是一种新近发现的促炎性细胞，过度活化的 Th17 释放IL-17、IL-23 等多种炎症细胞因子，并与树突状细胞、角质形成细胞等共同作用，形成细胞因子瀑布，连级放大炎症反应，最终诱导角质形成细胞过度增殖、中性粒细胞聚集。研究表明寻常型银屑病患者外周血中Th17 细胞比例升高，且寻常型银屑病患者外周血中 IL-17、IL-23水平显著高于健康人[7-9]。相反，Treg 细胞主要通过分泌 IL-10 和 TGF-β等抑炎性细胞因子，在维持机体免疫耐受、机体内环境的稳定中发挥重要作用[10]。Yan等[11]发现进展期寻常型银屑病患者Treg 细胞数目降低，而静止期和正常对照组外周血Treg 细胞数目无变化。

间充质干细胞是一种具有自我复制功能的成体干细胞，对T淋巴细胞具有独特的免疫调控功能，可以通过细胞与细胞直接接触和分泌IL-10、吲哚胺2 3-双加氧酶 和 TNF-α 等多种可溶性因子抑制促炎性 T 淋巴细胞的活化、增殖和分化成熟以及改变免疫细胞分泌的细胞因子，使其倾向于抗炎和免疫耐受功能，也可以促进抑制炎症反应的T 淋巴细胞的优势分化，以帮助机体恢复免疫平衡[1]，有研究显示，人骨髓来源的MSCs可下调Th17 特异性转录因子RORγt 的表达，调节Th17的功能[12]。同时有研究表明，寻常型银屑病患者皮损组织来源的MSCs在体外与外周血 T 细胞共同培养时，发现健康人皮肤组织来源的MSCs 对 T 细胞的增殖有抑制作用，但寻常型银屑病患者体内的MSCs 对 T 细胞增殖的抑制作用明显减弱[13]。笔者在前期对健康人和寻常型银屑病患者AMSCs免疫功能的比较研究中发现，在体外培养时，寻常型银屑病AMSCs较健康人AMSCs分泌的抑炎因子IL-10、吲哚胺2 3-双加氧酶、TGF-β及Toll样受体3等下降，肿瘤坏死因子-α、干扰素-Y等促炎细胞因子增强，寻常型银屑病AMSCs较健康人AMSCs免疫调控能力减弱[6]。

本研究通过AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养，探究患者AMSCs对外周血淋巴细胞的免疫调节作用。研究显示健康人和患者AMSCs可以促进Treg淋巴细胞增殖，但与健康人相比，患者AMSCs促进Treg淋巴细胞增殖的能力明显减弱，同时，患者AMSCs促进Treg淋巴细胞的核转录因子Foxp3及外周血淋巴细胞中IL-10和TGF-β表达及分泌的能力下降。推测可能是患者AMSCs表达和分泌抑炎因子的能力下降，导致促进Treg淋巴细胞优势分化的能力减弱有关。另外，健康人和患者AMSCs都可以下调Th17淋巴细胞比例，但是患者AMSCs对外周血Th17淋巴细胞比例的改变与健康人AMSCs相比无影响，患者和健康人AMSCs抑制Th17淋巴细胞转录因子RORγt及外周血淋巴细胞中促炎因子IL-17、IL-23表达和分泌的作用不明显，且两组细胞的作用无差异，推测患者AMSCs对Th17淋巴细胞的免疫调控作用影响较弱。

综上，本研究表明与健康人相比，寻常型银屑病患者AMSCs调控外周血Treg淋巴细胞免疫抑炎功能的能力明显减弱，而对外周血Th17淋巴细胞的促炎功能无影响，但因本研究样本量较小，且患者病情严重程度有差异等原因，可能致使研究有偏倚，另外，患者AMSCs具体如何参与调控寻常型银屑病外周血淋巴细胞免疫功能紊乱的病理机制尚不清楚，因此，有待进一步获得更多病例进行深入研究。