多黏菌素E耐药基因mcr-1在我国养殖场的流行及其传播扩散

王政 付玉林 汪洋 江海洋

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

多黏菌素类抗生素是多黏杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(A、B、C、D和E)。多黏菌素B和E被批准用于人医临床，多黏菌素E被批准用于动物[1]。多黏菌素E又称黏菌素，在养殖场中通常以硫酸黏菌素预混剂的形式作为饲料添加剂来使用，用来促进动物生长或治疗由肠杆菌科细菌引起的疾病。

多黏菌素E因其严重的肾脏毒性和神经毒性曾在临床上被禁止使用，但随着革兰阴性菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性越来越严重，20世纪90年代，多黏菌素E又重新被应用于临床，并被认为是临床上治疗多重耐药阴性菌感染的最后一道防线，世界卫生组织也已将其归为最关键的抗生素之一[1-2]。在我国，多黏菌素E于20世纪80年代初批准用于动物，但目前还未批准用于人医临床。细菌对多黏菌素E产生耐药性的主要机制，是细菌染色体编码的二元调控系统pmrAB和phoPQ以及相关的调控基因mgrB的突变导致脂质A的修饰发生改变，脂质A与多黏菌素E之间的静电作用力下降，从而使多黏菌素失去抗菌活性[3]。由于突变耐药菌只能垂直传播，所以在较长的一段时间内，临床调查显示细菌对多黏菌素E的耐药率都维持在一个较低的水平。但近年来，来源于动物养殖场的分离菌株对多黏菌素E的耐药率出现了明显上升，针对这一现象，Liu等[4]研究发现，一种编码磷酸乙醇胺转移酶的基因mcr-1，可介导细菌对多黏菌素E耐药。与突变耐药菌不同，该基因还可以发生水平传播。流行病学调查显示，携带mcr-1的细菌在动物养殖场已经广泛流行，分离率达21%，这表明mcr-1的流行是养殖场分离菌株对多黏菌素E的耐药率出现上升的主要原因[4]。虽然目前陆续有mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5等新的mcr变体被发现[5]，但是，在我国介导细菌对多黏菌素E耐药的基因仍然以mcr-1为主。

目前，mcr-1已在6大洲，30多个国家被发现，这表明mcr-1已在全球范围内形成了流行[6-7]。在我国，已有25个省/自治区分离到了携带有mcr-1的细菌。其中，在动物源细菌检测到mcr-1的省份或直辖市有黑龙江、新疆、宁夏、河北、湖北和重庆；在人源细菌中检测到mcr-1的省份有海南、广西、云南、江西、山西和甘肃；在动物源和人源都检测到了mcr-1基因的省份或直辖市有辽宁、山东、河南、安徽、江苏、浙江、福建、广东、台湾、四川、北京、上海和天津[8-13]。一份关于我国MCR-1阳性细菌的回溯性研究表明，在养禽场内MCR-1阳性细菌的分离率自2009年以来呈现出了逐渐上升的趋势[14]，与此同时，在动物源性食品和医院感染病人样品中也都分离到了携带有mcr-1的细菌[4]。mcr-1能否从养殖场内传播到养殖场外而威胁到公共卫生安全是研究者最关心的问题之一。为了评估mcr-1对人类公共安全的风险，在养殖场开展多黏菌素E耐药菌的流行病学调查显得至关重要，然而现在还没有针对我国养殖场中mcr-1流行规律的综合报道。本篇综述对我国养殖场内mcr-1的流行规律进行了总结，对养殖场内MCR-1阳性细菌由场内传播到场外的传播途径进行了归纳分析，以期找到mcr-1传播扩散的特点，为相关研究人员提供参考。

1 mcr-1在养殖场的流行特点

已有的报道显示，mcr-1在猪场、鸡场、奶牛场、淡水鱼养殖场中都有分布，其中猪场和鸡场中MCR-1阳性细菌的分离率较高[15-17]。目前分离得到的MCR-1阳性菌株都属于肠杆菌科细菌，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、抗坏血酸克吕沃尔菌等[18-20]。其中，mcr-1阳性大肠埃希菌的分离率最高[21]。本文将以mcr-1阳性大肠埃希菌为代表，从分子分型，质粒分型，基因侧翼环境3个层面来介绍mcr-1基因在肠杆菌科细菌中的流行特点。

1.1 mcr-1阳性大肠埃希菌的分子分型

目前使用最多的分子分型方法是多序列位点分型(multilocus sequence typing, MLST)，从MLST分型结果来看，mcr-1阳性大肠埃希菌的ST分型多样，没有主要的流行型。如Wang等[6]的研究显示，人医临床上MCR-1阳性细菌的ST型有ST602、ST101、ST410、ST95、ST1193、ST354、ST156、ST10、ST117、ST405、ST131和ST648等；Yang等[10]的研究显示，鸡源mcr-1阳性大肠埃希菌的ST型有ST48、ST10、ST616、ST88、ST744、ST117、ST3044、ST2491、ST2345、ST1642、ST5909和ST501等；猪源mcr-1阳性大肠埃希菌的ST型有ST1114、ST167、ST48、ST410、ST156和ST165等[22]。Zhou等[23]在浙江地区的河流中也检测到了16株MCR-1阳性细菌，ST型分别为ST10、ST101、ST206、ST181、ST1638和ST43。尽管上述研究者报道的多种ST型菌株来源不同，但经分析发现有一些ST型如ST10、ST156和ST648等在人和动物中都有分布，而ST10在人、动物和水环境中都有报道[6]。还有研究显示ST156和ST648大肠埃希菌与多重耐药菌有关，这两种ST型可同时含有mcr-1和blaNDM-5[24]。此外，ST648是人医临床上的流行性菌株，mcr-1/ST648的流行传播会给临床用药带来很大的挑战[24]。

不同环境、不同来源的菌株中都分离到了MCR-1阳性菌株，且拥有多样的ST分型，一方面说明mcr-1的传播是依靠水平传播元件介导的，另一方面也表明阳性菌株拥有很好的适应性。在其他种属如沙门菌中，携带有mcr-1的菌株ST型也多种多样[25]，但也有报道显示，ST34是鼠伤寒沙门菌的主要流行型[8,26]。

1.2 携带mcr-1的质粒分型多样

根据质粒不相容性原理可以将质粒分为不同的Inc型，同一Inc型的两种质粒不能共存于同一个细菌中。文献报道mcr-1基因多位于质粒上，其Inc分型有IncI2、 IncX4、IncHI1、IncHI2、IncF、IncFI、IncFII和IncP[27]。其中，IncI2和 IncX4在mcr-1阳性质粒中最为常见。IncI2型质粒是窄宿主质粒，通常只存在于肠杆菌科细菌中，该型质粒多可以发生接合转移。此外，该型质粒也与产超广谱β-内酰胺酶基因如blaCTX-M-55传播有关[28]。IncX4是大肠埃希菌中分布最广的质粒之一，也是窄宿主质粒，只能在肠杆菌科细菌中流行。该型质粒是自转移质粒，自身含有Ⅳ型分泌系统，松弛酶基因和结合蛋白基因，能够以较高的接合转移频率在同种细菌间发生接合转移[27]。尤其值得引起重视的是在一种广宿主质粒IncP中也发现了mcr-1[29]，这提示目前虽在肠杆菌科以外的细菌种属中尚未检测到mcr-1基因，但存在mcr-1传播到其他种属细菌中的可能。

1.3 mcr-1的传播流行与插入序列ISApl1密切相关

mcr-1的水平传播一方面与质粒相关，另一方面也与mcr-1的侧翼环境如插入序列相关。目前NCBI(national center for biotechnology information)上公布的含有mcr-1的序列结构显示mcr-1的侧翼中有一段保守的序列结构ISApl1-mcr-1-pap2。Tn6330(ISApl1-mcr-1-ISApl1)的发现证实mcr-1可以随着转座子的移动而发生水平转移[30]。Wang等[31]已报道目前mcr-1的侧翼序列至少可以分为8类。这表明mcr-1在质粒中正在经历一个适应的过程，如Sun等[27]的报道中提到了mcr-1在IncX4型质粒中有一个进化的过程。

总的来说，MCR-1阳性细菌已在我国养殖场(特别是养禽场和养猪场)中广泛流行，其传播方式以水平传播为主。质粒是介导mcr-1水平传播的主要元件，其可以在相同种属甚至不同种属的细菌间发生接合转移。此外，转座子Tn6330在mcr-1的传播中也起到了重要作用。通过以上传播机制，在药物的选择压力下，携带有mcr-1的细菌得以在动物源肠杆菌科细菌广泛传播。

2 mcr-1的传播扩散

根据现有的研究结果可以推测养殖场可能是mcr-1传播扩散的源头，一是因为养殖场MCR-1阳性菌株的分离率较高，而医院感染病人中的分离率相对较低[4]。二是因为养殖场和人类生活密切相关，如食源性细菌如空肠弯曲杆菌、艰难梭菌等可以通过食物链途径感染人类[32-33]。MCR-1阳性菌株基本都为肠杆菌科细菌，细菌一方面可以通过污染动物源性食品来进行传播扩散；另一方面，动物的排泄物通过堆肥处理后返田，也可能会污染农作物，如蔬菜，小麦等，进而威胁到公共安全[34]。

2.1 直接接触或食物链途径污染

mcr-1的传播扩散与食物链有关[35]，如Liu等[4]的报道中提到，从鸡肉等熟食中也分离得到了携带有mcr-1基因的菌株，Liu等[36]调查了深圳市超市或市场上销售的猪肉、鸡肉、虾等食品，共分离得到了109株mcr-1阳性肠杆菌细菌。这表明mcr-1基因有沿食物链传播的风险。养殖场内，mcr-1通过直接接触传播也有文献报道，如在老挝的一次流行病学调查中发现，养猪场一名饲养员粪便中分离的MCR-1阳性细菌，与猪粪便中分离的具有相同的脉冲场凝胶电泳(PFGE)谱型，提示该菌在动物和人之间发生了克隆传播[37-38]。

2.2 其他传播媒介

除食物链途径外，环境介导的传播，如水环境，土壤等[23,39]，也渐渐引起了人们的关注。其中养殖场污染物对周围环境的影响是人们研究的热点之一。现代化养殖场普遍采样高密度的动物养殖模式，而养殖场囤积的粪便污染物的处理一直是一个难题。动物的粪便一方面残留有抗菌药物或其活性代谢产物，同时也含有丰富的耐药菌或耐药基因。在动物粪便中就残留有多黏菌素E的活性代谢产物[40-41]。在我国，很多养殖场会通过堆肥的方式处理粪便，然后施用到农田中。堆肥虽然是有机肥料，但堆肥的使用也伴随着耐药基因或耐药菌随堆肥进入到了环境中，进而影响到人类[42-43]。我国是养猪大省，据统计，每年猪场大概会产生6亿吨堆肥，这不容忽视[44]。已有文献报道在猪场环境(土壤、堆肥等)中就分离得到了携带有mcr-1的细菌[45-46]。

除了堆肥等环境媒介可以促进耐药菌发生水平传播以外，一些重要的生物传播媒介如苍蝇等对耐药菌的传播也可能起到促进作用。Wang等[47]的研究表明，blaNDM在肉鸡生产链条中的传播扩散与苍蝇密切相关。扬州大学Zhang等[48]的研究也表明苍蝇在耐药基因传播过程当中起到的中介作用。

综上所述，养殖场内的MCR-1阳性细菌可能通过食物链或环境介质等由养殖场向养殖场外传播扩散，虽然目前还没有直接的证据证明mcr-1可以通过这些途径感染人群，但潜在风险不容忽视，Wang等[6]的研究就显示MCR-1阳性菌株的定植与病人生活地距离养殖场的远近有关系。

3 结论与展望

本文综述了mcr-1在我国养殖场的流行传播特点，简要阐明了其传播流行的机制，同时归纳了MCR-1阳性菌株由养殖场向养殖场外传播扩散的可能途径。由于携带mcr-1的质粒的多样性和良好的适应性，mcr-1在肠杆菌科细菌中形成了广泛流行，存在着由养殖场传播到养殖场外的风险。人们生活在同一个地球上，对抗耐药菌需要全世界的共同努力。目前，已有国家和地区采取了相应的措施来限制多黏菌素耐药菌的扩散传播，如我国农业部已在第2428号公告中明确提出，2017年4月30号前，硫酸黏菌素预混剂在养殖场将被禁止作为饲料添加剂来使用，在英国和欧盟也有类似的措施实施[1]。

限制多黏菌素E在养殖场的使用的只是防控细菌耐药性的第一步，还有很多问题需要人们去解决。对科研工作者来说，评估多黏菌素E的使用对MCR-1阳性菌株在养殖场传播扩散的影响以及对人类公共安全的威胁需要尽快完成；同时，在动物和人医临床上的耐药性监控需要继续加强，争取能形成定期的流行病学调查和监控；此外，探索有效经济的污染物处理方法也十分重要。就养殖场来说，应该规范养殖场的用药制度，明确兽医在养殖场的责任和义务。只有共同努力，我们才能更好的应对超级细菌带来的风险。