链霉菌抗生素生物合成中的细胞色素P450酶

潘丽霞 朱婧 王青艳 杨登峰

(1 广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室 国家非粮生物质能源工程技术研究中心，广西生物质产业化工程院 广西生物炼制重点实验室，南宁 530007；2 广西科学院广西北部湾海洋研究中心，广西海洋天然产物与组合合成生物化学重点实验室，南宁 530007)

细胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一类依赖于亚铁血红素，催化多种复杂氧化反应的多功能酶。它广泛地存在于各种生物体内，包括细菌，真菌，哺乳动物以及人体。之所以得名P450，是由于在催化过程中，其和亚铁血红素相互结合，形成硫醇-亚铁-一氧化碳复合物，该复合物在450nm处具有最大特征吸收波谱[1]。P450不但在有害异物的脱毒，类固醇的生物合成以及人体的药物代谢中起非常重要的作用[2-3]，而且在天然产物的生物合成中也起到非常关键的作用[4-5]。

放线菌，尤其是其中的链霉菌属，作为抗生素的主要来源之一，已经被人们研究了几十年。近年来，该菌属的P450酶取得了进一步的研究进展，主要表现在以下几个方面：一是随着基因组测序技术的普及化和廉价化，人们可以从基因组水平发现P450酶，对P450酶序列的发现呈爆发式增长，逐渐向大数据发展；二是合成生物学的快速发展，人们对链菌属来源的抗生素或者活性分子的生物基因簇的合成机制更加关注，对在基因簇中功能未知的P450酶做了深入地酶学特性鉴定；三是在结构生物学研究方面，相较于真菌或高等生物来源的P450酶，这些细菌来源的P450酶往往不是膜蛋白，这些样本更容易得到晶体结构，更多链霉菌的P450酶的蛋白质结构得到解析，这对P450酶的催化机制和结构基础的研究更加有利；四是链霉菌的P450酶不仅操作简单而且催化多样，适合作为研究酶催化改造的素材，化学研究人员陆续成功地开发出多种新的催化反应[6-8]。在本文中，对这些方面的最新进展都进行了综述。

另外，更多化学研究人员参与到对P450的研究中成为近年来的一个趋势。在化学合成中，碳氢活化反应是将氧原子插入到不活泼的碳氢键上，是反应最困难和研究最热门的反应之一，这类反应也可以由P450催化完成[9-11]。这使得P450酶成为目前在合成生物学、结构生物学、酶工程以及有机化学中，研究最为广泛的酶之一。

1 链霉菌P450的特点

1.1 P450催化反应的类型多

P450催化的反应类型之多[12-14]，是非常少见的。目前，在链霉菌属，功能已经有试验证实的P450酶大约有不到200个左右[15]。按大类主要分为氧化、脱氢、偶合以及各种成键反应。其反应具体涉及十几个反应类型，具体包括为羟化、环氧化、芳香环羟化、脱氢、硝化、芳香环的偶合、脱酰基、碳碳键形成、碳氮键形成、碳氧键形成以及碳硫键形成反应。

在氧化反应中，最基本的反应是羟化反应。在天然产物的合成中，大部分的P450酶是起到羟化的功能，大约占到所有功能的三分之二。P450也能催化环氧化反应和芳香环的羟化反应。环氧化反应经常可以在聚酮分子的合成中看到，因为这样的分子往往具有很多碳碳双键，可以发生环氧化来保持构型。例如PimD(CYP161A2)催化聚烯抗生素纳他霉素(pimaricin)的碳4位和碳5位产生环氧化[16]。OleP(CYP010D1)是一个在竹桃霉素(oleandomycin)合成中负责环氧化的P450酶，它环氧化碳8位和8a位上的两个碳原子[17]。阿嗪霉素B(azinomycin B)的生物合成途径中的AziB1是催化芳香环的羟化反应的P450酶，它负责芳香环萘甲酸上的羟化反应[18]。这类羟化反应的机制，被认为是首先发生在芳香环上的环氧化反应，环氧化开环，借助氢氢转移完成芳香环的重构。

脱氢反应中，P450酶可以完成2个或更多电子的脱氢反应，将一个sp3杂化的碳原子变为一个sp2或者sp1杂化的碳原子。对于脱氢反应的分类不是十分清楚，因为在经过2～3次脱氢后往往伴随着非酶反应的脱水，最终，形成酮、醛和酸。XiaM是一个在吲哚倍半萜厦霉素A(xiamycin A)生物合成途径中，将甲基转化为羧酸，还产生醇醛等中间体的P450酶[19]。另一个例子是在新型血管生成抑制剂Borrelidin途径中的BorJ，它可以在一个四电子氧化的过程，将一个甲基转化为一个醛[20]。另一类脱氢反应是由P450的去饱和酶完成的。当底物变为自由基形式，就会在拔取氢原子和羟化之间产生一个竞争，羟化的产物和去饱和的产物之间是不能互相转化的。一般是羟化的产物为主产物，但有时也有去饱和的产物是主要的产物的情况。在lactimidomycin(LTM)的生物合成中，LtmK可以将95%以上的LTM转化为8,9-dihydro-LTM。同时，产生小于5%的8S和9R的羟化产物[21]。GdmP(CYP105U1)是一个在格尔德霉素(geldanamycin)生物合成中的去饱和酶，允许自由基重绑定到底物上，在其发酵菌的发酵液中分离到两种立体构型的羟化产物[22-23]。这些结果表明去饱和反应是可以由酶反应来控制的。

偶合反应中，芳香环的偶合反应常常对天然产物起到多种不同的作用，能够创造出结构的多样性，如黑莫他丁(himastatin)和julichromes[24-25]；能够使柔性的骨架更加地刚性，如糖肽抗生素(glycopeptide antibiotics, GPA)和星形孢菌素(staurosporine)[26-27]；还能够聚合单体产生防晒的天然产物，如黑色素(melanins)[28]。天蓝色链霉菌的CYP158A1和CYP158A2分别可以聚合淡黄霉素(flaviolins)形成可以抵抗紫外线辐射的多聚体。尽管这两个蛋白有60%的序列同源性和相同的底物结合模式，但CYP158A1只形成二聚体的flaviolins，而CYP158A2至少形成4种flaviolins的聚合体[29-30]。相似的，灰色链霉菌的P450酶(CYP107F1)顺序地催化氧化1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene(THN)[31]，首先完成分子间的酰基偶合反应，再通过一个分子内的酰基偶合反应，最后，形成黑色素。目前，对于许多双酰基偶合反应，还不是很清楚这些酶是利用自由基机制，还是利用正离子机制。

成键反应中，StaP(CYP245A1)是一个负责分子内碳碳键形成的P450酶，它是在星形孢菌素的生物合成途径中，在两个chromopyrrolic acid的吲哚环之间形成碳碳键，经过一系列的质子化和异构化反应产生吲哚并咔唑(indolocarbazole)的六元环[32]。TxtE是一个来源于植物病原菌链霉菌的P450酶，参与植物毒素thaxtomins的生物合成，产生碳氮键的硝化发生在色氨酸的碳4位[33-34]。HmtT负责催化黑莫他丁中六氢吡咯环的碳氮键形成，氮原子进攻碳2位，形成碳氮键，碳3位上的羟基离去。相似的，StaN(CYP244A1)借助糖上碳5位的羟化，形成糖苷键，接着质子化脱水产生亲电的氧鎓正离子[35-36]。SgvP是一个在灰绿霉素(griseoviridin)的生物合成中，形成一个包含硫醇烯基团的9元环。据推测，这个反应是通过环氧化不饱和的胺基，引起硫原子亲核进攻α碳原子催化碳硫键的形成[37-38]。

1.2 P450催化反应的选择性好

由于羟基的引入，P450的催化往往具有构型和构象的立体选择性。在天然产物合成的过程中，这些反应可以让产物构型更稳定，同时，在天然产物的多样性中发挥非常重要的作用。在糖肽抗生素中最大的特点，是它的七肽骨架形成多个双芳香桥(C-C)或者双酰脂桥(C-O-C)，如著名的万古霉素。这些结构是由P450酶催化完成的，而且，这个结构的存在与否与这类化合物的活性密切相关的。如果线性的或者不完整的万古霉素中间体，就会失去了原有的良好的抗菌活性。在链霉菌中，GPAA47934具有4个这样的芳香桥，而万古霉素只有3个这样的芳香桥。4个CYP165家族的P450酶，StaH、StaG、StaF和StaJ分别负责C-O-D环，F-O-G环，D-O-E环和A-B环合成[31,39]。这些酶都具有自身独特地催化位点，并形成具有立体选择性的结构。

1.3 P450催化反应的功能多

P450在催化过程中，往往一个酶具有多步催化功能。最为著名的是PikC(CYP107L1)，它可以催化完成在不同大环内脂环上的7个不同位置的羟化反应，它可以催化12元环内脂产生抗生素酒霉素(methymycin)和新酒霉素(neomethymycin)，在不同位置完成两次羟化反应产生抗生素novamethymycin[40-41]，也可以催化13元环抗生素那波霉素(narbomycin)产生苦霉素(pikromycin)[42-43]。来源于链霉菌Streptomyces thioluteus的P450酶AurH，在金链菌素(aureothin)的生物合成中，催化合成具有立体选择性的四氢呋喃环。两个碳氧键按顺序地形成：首先是碳7位的亚甲基产生一个羟化的中间体，然后，是新产生的羟基和碳9a位[44-45]。目前，还不知道是否这种杂环化是利用一个双羟基中间体还是自由基中间体来完成，相似的机制也出现在阿维菌素的合成过程中。

1.4 P450在基因组水平大量存在

不同于一般细菌中，P450数量较少或者甚至没有，例如大肠埃希菌和鼠伤寒沙门菌都没有P450酶基因的存在[46-47]，在链霉菌中，存在相对多的P450酶基因。例如两个工业化生产菌种，阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)，分别产生阿维菌素和放线紫红素，已经完成了全基因组的测序[48-49]。在这两个菌种中，都发现了大量的P450酶基因，分别是18个和33个，占到全部编码基因的0.2%和0.4%[50-51]。这个数字大大高于其他细菌中的P450数量。目前，在链霉菌中，大概有180个功能已知P450酶，无论是通过体外试验、基因敲除，还是异源表达和结构学研究，但还有大量未知功能的P450酶有待于去进一步功能解析。

2 链霉菌P450的最新进展

2.1 P450在合成生物学上的进展

2015年，中科院南海海洋所的张长生课题组完成了heronamide生物合成途径中的后修饰的P450酶HerO的发现，该酶催化碳8位的羟化反应[52]。抗生素oleandomycin生物合成途径中的负责环氧化的P450酶OleP也完成了功能和结构的鉴定工作，该酶是目前唯一一个在未激活碳碳键上完成环氧化的P450酶[53]。利用比较全基因组学，挖掘thiolactomycin的生物合成基因簇时，发现了一个不常见的P450酶，该酶负责thiotetronate ring的形成[54]。在研究pentalenolactone的时候，在最后一步修饰时，发现一个催化氧化重排的P450酶[55]。在platensimycin的生物合成途径中，发现了形成脂环的P450酶[56]。另外，对pimaricin基因簇中的P450酶的删除，可以产生一些新的结构类似物，这些类似物表现出更好的的抗真菌活性[57]。同样的情况，也出现在natamycin的生物合成中[58]。

2.2 P450在结构生物学上的进展

最早的P450酶的晶体结构是于1985年被解析，是一个来自于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的P450酶(CYP101A1)[59]。随后，每年P450的结构都会有较大幅度的增长。到目前为止，蛋白质数据库(protein data bank, PDB)中，来自于链霉菌的有29个，13个是来自于聚酮的，8个是来自于非核糖体肽的，3个是来自于聚酮-非核糖体肽杂合体的，4个是来自于萜的生物合成途径。另外，还有一个是未知功能。

2017年，参与griseoviridin生物合成的P450酶SgvP，作为第一个形成碳硫键的P450酶，得到了2.6埃的晶体结构，结构显示Pro237在碳硫键的合成中起到关键作用[60]。糖肽抗生素合成中，NRPS(nonribosomal peptide synthetase)中的X-domain和P450的复合物结构也得到了解析，为NRPS与外源蛋白相关作用的研究提供了结构基础[61]。糖肽teicoplanin中负责环化D-O-E环的OxyA的晶体结构也得到了解析[62]。另外，一些来源于链霉菌中新的P450酶结构也到的了解析，如参与消炎药物diclofenac和阿维菌素合成的CYP105D7和CYP107L2[63-64]。

2.3 P450在分子改造上的进展

PikC是一个对十元环和十二元环大环内脂都能进行两位点羟化的P450酶。这是一个系统研究的酶，从野生型、共结晶以及突变型的蛋白质结构，到计算机模拟，产业化应用平台的构建，将非专一性改造为可以进行精准羟基化的酶。首先，是它的晶体结构和不同底物YC-17和那波霉素的共结晶结构(PDB ID: 2C6H,2C7X)获得了解析[65]，结果表明红霉脱氧糖胺以两种不同的方式和酶结合，一种是深埋的，一种是暴露的。消除Asp50的负电荷可以明显地增加酶的活性，在突变体Asp50Asn的晶体结构中，底物和酶都是以深埋的方式结合的，这样，它的两步底物结合机制被推测。利用底物工程化的技术，可以将碳10位和碳12位的产物从原来1:4变为20:1[66]。另外，通过分子动态模拟和底物工程化策略，在共结晶结构的基础上，结合计算机计算，对P450酶PikC进行蛋白质工程，得到了可以催化不活泼碳氢键的新活力，现在该酶已经构建成为工业应用的一个平台[67]。

AurH是一个存在于聚酮抗生素金链菌素生物合成途径中的多功能P450酶，分子改造是使其接受新的底物，产生新的产物。AurH随机的氧化碳7位和碳9a位导致四氢呋喃的形成。它的晶体结构(PDB ID:3P3L, 3P3O, 3P3X, 3P2Z)是第一个CYP151A亚家族的P450酶结构。蛋白配体对接模式显示底物的吡喃酮环占据了一个疏水的活性口袋，通过改变活性口袋大小，来实现新反应。突变体Phe89Trp和Thr239Phe明显地减小了酶的催化效果，并且产生了一种新的金链菌素的类似物[68]。大的氨基酸色氨酸和苯丙氨酸借助位阻效应改变了底物吡喃酮的绑定模式。这些突变体催化立体选择六电子的转化，借助羟基和醛基的中间体，将没有活性的碳9a位上的甲基变为羧酸。同时，在相关突变体菌种的发酵液中，分离到新型的结构类似物。

在分子改造方面，美国加州大学的Arnold课题组做出了非常的突出的贡献。TxtE是第一个报道的有效催化硝化底物色氨酸的酶，分子改造是改变其底物结合位点，将硝化反应的位点从色氨酸的碳5位变为色氨酸的碳4位。它的单独晶体结构和含有色氨酸底物复合物的晶体结构已经得到解析，但是由于天然状态下该酶F-G环的不稳定，导致并没有搞清楚该环是如何和底物色氨酸如何相互作用的。借助计算机分子动态模拟软件，使用马尔科夫状态，对F-G环的开环、闭环和过渡态3种状态进行了重构。处于F-G环上的His176对于酶的不同状态起到关键的控制作用[69]。计算结果显示增加了176位的空间位阻，导致底物结合位点的偏移。

3 结语

P450酶作为自然界中存在最广泛和催化最多样的酶，在链霉菌属广泛存在，对它们的研究还只是一小部分，有待于进一步研究。P450酶作为一个金属蛋白，在催化过程中，可以说借助蛋白为载体，实现了金属催化。而更多化学背景的研究人员开始利用P450酶完成一些新的催化反应，将酶催化和过渡金属催化相结合，让生物学和化学充分融合，相信这个方向还会有更多有意思的研究出现。同时，借助计算机的动态模拟和共结晶的晶体学手段，相信对于P450酶的研究可以更上一个台阶，从分子水平对P450酶的催化机制做进一步解析，为后续的蛋白质改造奠定理论基础。结合定向改造的方法，让这些酶发挥出更大的作用，完成更多特异性的反应。另外，基因组研究的快速发展加速了酶的研究，人们不再单纯的依赖表型或现象去发现酶，全基因组测序技术可以让你马上发现所有备选的酶，为快速研究酶提供了新的可能。目前，本课题组以围绕部分链霉菌的P450展开结构生物学研究，相关工作会在后续报道。