ISSR分子标记技术在石榴中的应用

张 慧，朱 薇*，韩 腾，王庆军

（1枣庄市特色果品工程推广站，山东枣庄 277000；2枣庄市石榴研究中心）

石榴（Punica granatum L.）属被子植物门，双子叶植物纲，原始花亚纲，为千屈菜科（Lythraceae）石榴属（Punica L.）落叶灌木或小乔木。石榴在中文版《中国植物志》中归属于石榴科石榴属植物，而新版《Flora of China》将石榴属归并到千屈菜科[1]。石榴又称安石榴、涂林、丹若、海榴等，原产于伊朗、阿富汗等地，向东传播到东亚等国，向西传播到地中海地区及美洲各适生地[2,3]。在长期栽培中，因基因突变、天然杂交、人工选择形成了丰富的种质资源，在全世界范围内有1000多个石榴品种及野生型品种[4]。ISSR分子标记技术是石榴分子资源遗传多样性、亲缘关系与分类学研究的有力工具，能够直接从DNA分子水平上反映各材料间的遗传差别。本文系统地介绍了国内外ISSR分子标记在石榴分子资源遗传多样性研究、亲缘关系与分类学研究中的应用进展，以期为石榴种质资源的收集、保存、遗传多样性分析和亲缘关系鉴定等研究提供科学的理论依据。

1 I SSR分子标记

ISSR（简单重复序列）分子标记技术，是由Zietkiewicz等[5]，在1994年以DNA重复序列为重点，基于一种SSR微卫星基础上发展起来的分子标记技术，被人工合成的16～18个SSR序列，在其3′端或5′端加锚1～4个嘧啶碱基或嘌呤，使用引物对反向排列SSR的DNA序列进行PCR扩增,并对其电泳、染色，通过谱带的相对位置和有无，来研究不同试材间的多态性，ISSR分子标记技术采用重复序列技术组合和PCR技术建立起来的一种广泛用于于石榴中微卫星基础上的分子标记技术[6]。ISSR分子标记的优点如下∶ISSR分子标记技术克服了RAPD、AFLP、RFLP和SSR的技术性缺点，具有经济、省时、易操作、多态性高、稳定性强、重复性高、无需测序和克隆等优势。

2 I SSR分子标记技术在石榴中的应用

2.1 石榴遗传多样性的研究

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，一个物种的遗传多样性越丰富，适应环境变化的能力就越强[7]。

王庆军等[8]利用ISSR分子标记技术对山东和美国等地的35个观赏石榴品种的遗传关系及分类分析。通过筛选出8条多态性高的ISSR引物对35个观赏石榴品种进行扩增，扩增出168个基因位点，其中158个为多态性基因位点，多态性位点比高达94.05%。平均有效等位基因数1.6785、平均观察等位基因数1.9405、平均Shannon信息指数0.5530、平均Nei's基因多样性指数0.3799。35个观赏石榴品种间遗传相似系数分布范围为0.4167～0.9226，说明其品种间具有丰富的遗传多样性。马丽等[9]以65个果用石榴品种为材料，采用ISSR分子标记研究了果用石榴类群品种的遗传多样性及亲缘关系。结果表明∶通过筛选出10条多态性高的ISSR引物进行扩增，扩增出186个DNA位点，其中161个为多态性DNA位点，多态性位点比高达86.56%，等位基因数、有效等位基因数、Nei′s基因多样性指数、Shannon 信息指数分别为∶1.8656、1.3119、0.2092、0.3389。65个果用石榴品种间遗传相似系数分布范围为0.478～0.995，说明其品种间具有丰富的遗传多样性。Narzary等[10]通过ISSR分子标记技术对49个印度野生石榴品种进行遗传多样性分析，通过筛选出17条多态性高的ISSR引物对49个印度野生石榴品种进行扩增，扩增出308个基因位点，其中268个为多态性基因位点，多态性率高达87.01%，多态性介于71.43～100.00之间，平均观察等位基因数1.3375、平均有效等位基因数1.2250、平均Nei's基因多样性指数0.1250、平均Shannon信息指数0.1888，遗传距离分布范围为0.05～0.45，平均是0.25，表明野生石榴遗传多样性较高。赵丽华[11]采用ISSR分子标记技术分析中国石榴居群遗传结构的ISSR。结果表明∶7个石榴种群遗传多样性从小到大依次为∶新疆种群、四川种群、安徽种群、河南种群、云南种群、陕西种群、山东种群；7个石榴种群间的基因分化系数是0.1911，表明种群间的遗传变异占总遗传变异比率为19.11%，种群内的遗传变异占总遗传变异比率高达81.89%，种群间表现较低遗传分化；7个石榴群间基因流的估测值是2.1169，遗传相似性分布范围为0.9218～0.9759，表明石榴种群间具有很高的遗传相似性及强大的基因流，因此石榴品种间的遗传多样性才能够得以维持。王庆军等[12]还筛选8条ISSR引物对24个山东石榴品种进行遗传多样性分析。扩增出178个基因位点，平均每条引物扩增出22.25个基因位点，其中多态性基因位点122个，多态性位点比率是68.54%。平均有效等位基因数1.3790、平均观察等位基因数1.6854、平均Shannon信息指数0.3453、Nei’s基因多样性指数 0.2282；24 个山东石榴品种的遗传相似系数介于0.6742～0.9101，说明ISSR分子标记技术可有效用于山东石榴品种的遗传多样性分析。

2.2 石榴亲缘关系与分类学研究

石榴在长期栽培和传播过程中，因基因突变、天然杂交、人工选择形成了丰富的种质资源，所以具有比较复杂的遗传背景，传统的形态标记、细胞标记和生化标记等在对石榴进行分类研究时，均存在一定的缺陷，不具备很强的说服力，而从DNA层面进行研究的ISSR标记技术可以很好地解决这一问题。

Ghobadi等[13]利用ISSR分子标记技术筛选出6条引物对24个伊朗石榴品种进行亲缘关系分析，多态性条带是64条，在65%相似性水平下，24个伊朗石榴品种被分为5个类群，分析结果表明，ISSR分子标记与形态学分类结果不完全一致。沈进[14]采用ISSR技术筛选出17条引物对中国45份石榴种质进行亲缘关系分析，扩增出条带数有187，其中多态性条带有157条，平均每个引物11条，多态性比率高达83.96%。利用聚类分析，以遗传距离阀值为19时，45份石榴种质被聚为4类，结果表明ISSR分子标记与形态学分类结果不一致，同时也赞同了Ghobadi等的结论。赵丽华等[15]利用ISSR分子标记技术对47个石榴品种进行遗传关系分析，47个石榴品种通过筛选出6条引物进行扩增，扩增出120条基因条带，其中多态性条带有109条，多态性比率高达90.83%，平均Nei’s基因多样度0.1897、平均有效等位基因数1.2945、平均Shannon信息指数0.3091、遗传距离为 0.0750～0.4000，表明 47个石榴品种间具有比较丰富的遗传多样性,利用UPGMA法构建分子树状图，以遗传相似性系数0.7767为阈值，将47个石榴品种分为5个类群，分类结果与地理和形态分布无关。Ajal等[16]筛选出8条引物，利用ISSR分子标记技术对摩洛哥27个石榴品种进行遗传多样性分析，扩增出70条条带，其中61条为多态性条带，多态性率高达87.14%，多态性范围42.86～100.00，遗传距离介于0.12～1.00，平均为0.67，总基因多样性参数为0.35及群体内基因多样性参数为0.32，且种群间基因流较大为5.8，ISSR聚类结果表明与品种的地理来源无关，同时也赞同了赵丽华等[15]的结论。

3 问题与展望

随着对石榴种质资源重要性的认识不断加强,石榴种质资源的收集、保存、合理评价及有效利用等问题越来越受到石榴种质资源相关部门和工作者的重视。分子生物学尤其是分子标记的发展为石榴资源提供了更为清晰的遗传背景,ISSR分子标记作为一种新型分子标记技术，在石榴分子资源遗传多样性研究、亲缘关系与分类学研究等方面已取得了较大进展与广泛的应用。但与其它果树相比，ISSR应用于石榴研究起步晚，基础差，仍然存在不足，比如ISSR大部分为显性标记，不能区分纯合体与杂合体，因此在进行两倍体或多倍体物种的种群多样性研究时，目前还未找到一种合适的数学模型来对其数据分析[17]。当今，由于石榴集经济、营养、生态、观赏等价值于一体，所以越来越受到消费市场的青睐，国内外石榴产业迅速发展[18]。相信随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展和改进，ISSR分子标记技术凭借其经济、简便、快速、多态性高、稳定性强、节省时间、财力和物力等优点必将使其在石榴领域越来越得到广泛应用，特别是应用于大批量材料的研究，对石榴种质资源研究发挥更大的作用。