蝉花虫草分类地位及其遗传多样性研究进展*

李建平，张 铁，曾文波**

（1.文山学院三七学院，云南 文山 663099；2.文山学院文山州生物资源开发研究中心，云南 文山 663099）

蝉花虫草（Isaria cicadae）是我国传统的名贵中药材，作为1种药食两用真菌，在中国已有至少1 500多年的应用历史，比记载中冬虫夏草的应用还要早200多年[1-2]。蝉花虫草中功效成分主要包括多糖、虫草酸、水溶性核苷类成分、氨基酸、麦角甾醇、环肽类、多球壳菌素、有机酸等[3]，其中，水溶性核苷类成分包括尿嘧啶、尿苷、2’-脱氧尿苷、鸟苷、胞苷、次黄嘌呤、肌苷、胸腺嘧啶、胸苷、2’-脱氧腺苷，N6-(2-羟乙基)腺苷等[4-5]。蝉花虫草具有免疫调节、滋补强壮、改善肾功能、抗肿瘤、抗疲劳、抗应激、抗氧化及抗衰老、解热、镇痛、镇静、降血糖、降血压等多种功效及药理作用[3]。因此，蝉花虫草是1种具有巨大开发价值的药用真菌。但是，长期以来，蝉花虫草分类学地位几经变动，加上其他一些虫草易被混淆为蝉花虫草，使得相关文献报道混乱，不利于蝉花虫草的研究及开发利用。因此，有必要对蝉花虫草的分类地位及其生物多样性文献进行梳理。通过对蝉花虫草的历史记载、分类地位及遗传多样性等3个方面进行了综述，以期为蝉花虫草的研究和开发利用等提供参考。

1 蝉花虫草的历史记载

关于蝉花虫草最早的文字记载可追溯到公元5世纪南北朝，雷敩所著《雷公炮炙论》中记载：“凡使，要白花全者。凡收得后，于屋下东角悬干，去甲土后，用浆水煮一日，至夜，焙干，碾细用之”[1]。这是关于蝉花虫草形态、保存和服用方法最早的记载。隋唐时期，甄权所著《药性论》对蝉花虫草的形态有了进一步的描述，并解释了“蝉花”之名的由来，此外，还记载了其功效及药性，该书关于蝉花虫草的记载“其蜕壳，头上有一角，如冠状，谓之蝉花，最佳。味甘寒，无毒。主小儿天吊，惊痫螈，夜啼心悸”[3]。宋朝苏颂等编写的《图经本草》中关于蝉花虫草记述“今蜀中有一种蝉，其蜕壳头上有一角，如花冠状，谓之蝉花人药最奇”[6]，该书记载了蝉花虫草的产地，对于蝉花虫草形态有了更加细致的描述，即蝉花虫草的孢梗束从寄主蝉若虫的头部长出，其孢梗束顶端呈花冠状。宋代唐慎微《经史证类备急本草》[7]关于蝉花虫草记载“味甘，寒，无毒。主小儿天吊，惊痫螈，夜啼心悸。所在皆有，七月采。生苦竹林者良，花出土上”。该书对蝉花虫草的生长时间、生境、毒理及药理作用进行了记述,“所在皆有”说明蝉花普遍存在，产量较大。明朝李时珍所著《本草纲目》中关于蝉花虫草记载《经史证类备急本草》一致。考古学家从西周至秦（公元前1000年～公元前200年） 的文物中发现贵族的随葬品内有口含的青玉雕刻的蝉体状装饰品及佩带的玉雕僵蚕，我国著名真菌学家臧穆认为，这很可能是象征良药治病，祈福余荫的意思[8]，表明古人已经认识到僵蚕及蝉花虫草，希望死者能像僵蚕和蝉花虫草一样死后尸体不腐，像蝉变成蝉花一样从长眠中醒来。笔者将蝉花虫草的分布区域与周朝及秦朝的疆域进行了比较，周朝的疆域主要包括我国今山东、河南的大部分地区，河北、山西的南部，陕西的中部，甘肃的东部，江苏、湖北、安徽的北部[9]；秦朝疆域为东、南到海，西到今甘肃、四川，西南至云南、广西，北到阴山，东北至辽东[10]。蝉花虫草分布在我国秦岭—淮河以南18个省区[3，11]，由此可知，周朝及秦朝的疆域与蝉花产地大部分重合，表明古人具备认识蝉花虫草的客观条件。考古学的发现及蝉花虫草相关文字记载，表明我国劳动人民对于蝉花认识约有3 000年的历史，应用历史至少有1 500多年。

根据蝉花虫草相关记载中的描述[2-3，6-7]，“蝉花”一词在历史上应指的是真菌蝉棒束孢Isaria cicadaeMiquel寄生蝉若虫形成的虫菌复合体。此外，在历史上和现今，“蝉花”的应用主要是以蝉棒束孢Isaria cicadae为主体，其产量及分布范围是其他“蝉花”混淆品所不能比拟的[3，11]，鉴于棒束孢属IsariaPers.已经被Kepler等[12]于2017年废除，本文中采用“蝉花虫草”作为该真菌的中文名，拉丁名暂时使用Isaria cicadaeMiquel，下文将会对其分类地位进行分析讨论。

2 蝉花虫草的分类地位

“蝉花”一词为蝉花虫草的俗称，不是分类学上的名词，是真菌蝉棒束孢Isaria cicadaeMiquel寄生于蝉若虫后形成的虫菌复合体，孢梗束自虫体头部丛聚成束长出，浅黄色，长1.5 cm～6.0 cm，前端膨大，呈纺锤形。其主要鉴别特征是分生孢子梗上的分枝多局限于顶部，瓶梗粗而短，密集，分生孢子较大，常弯曲。蝉棒束孢于1838年，由Miquel首次定名[13]，之后出现了基生球壳孢Sphaeria basiliTaylor（1844年），辛克莱球壳孢Sphaeria sinclairii Berk.（1855年）、基生棒束孢Isaria basili（Taylor）Kobayasi=Sphaeria basiliTaylor（1941年）、蝉虫草Cordyceps cicadae（Miquel）Massee（1895 年）、蝉拟青霉Paecilomyces cicadae（Miq.） Samson（1974 年）和大蝉草Cordyceps cicadaeShing（1975年） 和蝉拟青霉Paecilomyces cicadae（雌蝉花） 等[14-17]。自1974年以后，相关文献记载主要以蝉拟青霉P.cicadae为主。2004年，Luangsa-ard等[18-19]通过核糖体内转录间隔ITS、核糖体小亚基nrSSU和β-微管球蛋白β-tub等基因序列的系统发育分析发现，拟青霉属Paecilomyces是多元发生的，该属不是一个自然分类单元。Luangsa-ard等[18]将蝉拟青霉P.cicadae等重新移入棒束孢属（IsariaPers.）。棒束孢属的特征为分生孢子梗单生或束丝状，常由数个轮状分支组成，其上着生由瓶梗组成的轮生体。瓶梗基部柱状或膨大，向上变细呈细长的颈部，形成离散的分生孢子链。分生孢子单孢，偶有双细胞，壁光滑，透明。菌落白色、黄色、淡绿色、肉红色、红色或紫色等明亮色调。菌丝透明至微色，粗糙或光滑，一些种具有厚垣孢子。常见的棒束孢属物种有蝉棒束孢Isaria cicadae、细脚棒束孢I.tenuipes、鲜红棒束孢I.amoenerosea、斜链棒束孢I.cateniobliqua、玫烟色棒束孢I.fumosorosea、环链棒束孢I.cateniannulata和粉质棒束孢I.farinose等。

近十多年以来，广义虫草属Cordyceps(Fr.)Link s.l.的分类地位发生了较大的变化。2007年，Sung等[20]基于核糖体大亚基nrLSU、核糖体小亚基nrSSU、真核生物翻译延伸因子1α（tef1α）、真核生物RNA聚合酶II最大亚基rpb1和第二大亚基rpb2、β-微管球蛋白β-tubulin和线粒体atp6七个基因片段对虫草及相关真菌162个分类群的分子系统研究发现，广义虫草属Cordyceps(Fr.)Link s.l.和广义麦角菌科Clavicipitaceae s.l.并不是一个单系类群，并根据聚类关系把广义麦角菌科分为3个科，分别是虫草科 Cordycipitaceae、线虫草科 Ophiocordycipitaceae、狭义的麦角菌科 Clavicipitaceae s.s.，广义虫草属分为4个属，分别是狭义虫草属Cordycepss.s.、泛虫草属Metacordyceps、线虫草属Ophiocordyceps和大团囊虫草属Elaphocordyceps，棒束孢属物种隶属于虫草科 Cordycipitaceae、虫草属Cordycepss.s.，这也产生了矛盾，即狭义虫草属下包含了棒束孢属Isaria、蚧霉属Lecanicillium、虫壳属Torrubiella和白僵菌属Beauveria等多个属，有待进一步的研究并修订；Kepler等[12]采用nrLSU、nrSSU、tef1α、rpb1和rpb2等5个基因片段开展虫草科Cordycipitaceae系统分类研究，将虫草科Cordycipitaceae狭义虫草属Cordycepss.s.划分为 11个属，分别为虫草属Cordycepss.s.、刺束梗孢属AkanthomycesLebert、球束梗孢属GibellulaCavara、白僵菌属BeauveriaVuill.、多孔囊菌属AscopolyporusMöller,Bot.Mitt.、侧齿霉属Engyodontiumde Hoog、厚盖霉属HyperdermiumJ.F.White,R.F.Sullivan,Bills&Hywel-Jones、拟侧齿霉属ParengyodontiumC.C.Tsang et al.、单梗霉属SimplicilliumW.Gams&Zare、哈利埃文斯菌属HevansiaLuangsa-ard，Hywel-Jones&Spatafora、布莱克威尔霉属BlackwellomycesSpatafora&Luangsa-ard。Kepler等（2017）[12]研究发现棒束孢属为多系起源，部分该属物种甚至超出了虫草科的范畴，Kepler等建议废除该属名，Kepler等已经将细脚棒束孢I.tenuipes、粉质棒束孢I.farinose等与蝉棒束孢I.cicadae具有较近亲缘关系的物种，分别修订为细脚虫草Cordyceps tenuipes和粉质虫草C.farinose，蝉棒束孢I.cicadae可能将被移入到狭义虫草属Cordycepss.s.，历史上Massee和我国学者幸兴球都曾使用Cordyceps cicadae进行物种命名，但都是不合格命名[3]。因此，其种加词有待进一步的研究确定，考虑到该真菌为我国传统中药材，具有重要的开发价值，中文名建议使用蝉花虫草。

3 蝉花虫草遗传多样性

生物多样性包括生态多样性、物种多样性和遗传多样性。检测遗传多样性的方法随着遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善。通常依据时间线，遗传多样性的检测分为形态学水平、细胞学水平、生化水平、核酸水平。任何一种检测遗传多样性的方法都存在各自的优点和局限，各种方法都能从各自的角度提供有价值的信息，都有助于人们认识遗传多样性及其生物学意义。蝉花虫草属于全球广布种，产地众多，蝉花虫草在生境、形态、化学成分和核酸水平等多个层次具有多样性[3-4，11，13，21-22]。

3.1 生态多样性

蝉花虫草为世界性广布种，包括中国、韩国、日本、南亚、欧洲、北美等国家及地区，在我国分布于秦岭—淮河以南18个省区，分布在海拔10 m～2 800 m，生长期为6月～10月，适宜温度18℃～30℃。蝉花虫草的繁盛期根据各地水热条件有一定的差异，蝉花虫草生长于热带和亚热带的常绿阔叶林、落叶阔叶林、针阔叶混交林及竹林等生境，蝉花虫草在上海、浙江、福建、安徽、江苏、广东和江西等地多分布于竹林，在云南、四川、贵州、陕西、海南和广西等地则多生长于阔叶林和针阔叶混交林[3，11]。笔者调查发现，蝉花虫草在竹林的产量明显高于其它生境。蝉花虫草寄主包括山蝉Cicadae flammata、蟪姑Platypleura kaempferi、黑蚱Crytotympana pustulata、竹蝉Platylomia pieli、云南黑蝉Cicadatra shaluensis和鸣鸣蝉Oncotympana maculatieollis等蝉科昆虫的若虫[3，11]。由上可知，蝉花虫草分布广，可感染多种寄主，对生长条件要求不严格，能适应多种生态环境。

3.2 形态多样性

陈祝安等[3]和刘爱英等[13]均对蝉花虫草的形态及无性型菌丝体形态多样性进行描述，但相关描述主要针对少数个体，而不是以居群为单位进行统计分析，不能反映蝉花虫草物种水平、居群水平的形态多样性。李建平等和曾文波等分别开展了不同居群（population）的蝉花虫草及其无性型菌丝体形态性状研究，一定程度上揭示了蝉花虫草形态变异式样[21-22]。

李建平等[21]对蝉花虫草的形态多样性进行了分析，该研究选取了10个居群的蝉花虫草，测定了其菌核长、菌核周长、孢梗束分枝数、分枝长、分枝周长、菌核质量、孢梗束质量、子实体质量等12个形态性状。采用SAS 8.1软件对蝉花虫草形态性状数据进行描述性、巢式方差和Q聚类分析。描述性分析表明，蝉花虫草居群12个形态性状的变异系数（CV值） 在12.97%～162.57%之间，在物种水平表现出丰富的变异；巢式方差分析表明，蝉花虫草12个形态性状在居群间平均方差分量占总变异的33.79%，居群内个体间平均方差分量占总变异的66.21%，说明蝉花虫草居群内个体形态性状变异丰富，是形态性状变异的主要来源，居群间形态性状分化不明显。此外，Q聚类分析表明蝉花虫草居群形态性状具有一定的地理相关性[21]。

曾文波等（2017）[22]开展了蝉花虫草无性型菌丝体形态多样性研究，选取了15个居群，共75个菌株，观察和测量了菌丝、产孢结构和分生孢子等部位共17个显微形态性状，采用SAS 8.1软件对蝉花虫草无性型显微形态性状数据进行描述性、巢式方差和Q聚类分析。结果表明，蝉花虫草无性型具有大小两型分生孢子，产孢细胞的形态可分为葫芦状和瓶状2种类型；蝉花虫草在PDA培养基中易形成数量众多的厚垣孢子，菌丝间多能形成融合菌丝，并可观察到少量的融合菌丝在厚垣孢子与菌丝间、产孢细胞间形成。描述性分析表明，蝉花虫草居群17个形态性状的变异系数（CV值）在 13.07%～104.09%，在物种水平表现出丰富的变异；巢式方差分析表明，蝉花虫草菌株显微形态性状在居群间平均方差分量占总变异的11.29%，居群内个体间平均方差分量占总变异的15.27%，菌株内观察值间平均方差分量占总变异的73.44%。蝉花虫草菌株形态性状变异丰富，是形态性状变异的主要来源，蝉花虫草居群显微形态性状不存在明显的地理相关性[22]，这与蝉花虫草宏观形态的结论不一致，这可能与其寄主和生境有关，即不同产地的蝉花虫草寄主不同，对于蝉花虫草菌核的大小、重量，孢梗束等影响明显，不同生境的表层土壤及枯枝落叶等对其孢梗束的形态具有较大的影响[3]，使得蝉花虫草宏观形态具有地域特征，而蝉花虫草菌丝体形态性状只与菌株本身遗传特性有关，使得菌丝体形态性状在居群间的平均方差分量占比（11.29%） 小于宏观形态性状（33.79%）。

由上可知，蝉花虫草宏观形态及菌丝体形态变异式样基本一致，即形态变异主要来自居群内个体，居群间分化不明显。这可能与蝉花虫草的繁育方式有关，即蝉花虫草自然条件下主要是以产生无性分生孢子的方式进行无性繁殖，这使得其遗传物质相对稳定，另外，结合蝉花虫草在全球的分布情况，说明蝉花虫草具有较强的扩散传播能力，使得居群间分化也较小。

3.3 生化水平多样性

核苷类成分是虫草中主要的有效成分，包括尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷、2-脱氧腺苷和虫草素等。Zeng等[4]测定了10个居群的蝉花虫草的菌核及孢梗束中的尿嘧啶、尿苷、2’-脱氧尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、胸苷、腺苷、2-脱氧腺苷9个核苷类成分，采用SAS 8.1软件对蝉花虫草菌核及蝉花虫草中核苷类成分进行描述性、巢式方差和Q聚类分析。描述性分析结果显示，菌核部分和孢梗束部分核苷类成分的变异系数（CV值）分别在 10.77%～155.87%，以及 8.36%～112.36%，巢式方差分析表明，孢梗束中核苷类居群间平均方差分量百分比为42.29%，居群内个体间平均方差分量占比为57.71%，表明核苷类成分的变异来源有42.29%来自于居群间，57.71%变异来自居群内个体间，表明蝉花虫草孢梗束部分居群内个体间核苷类成分含量变异较居群间多，但是居群间核苷类成分含量也出现了一定的分化。菌核中核苷类成分有28.94%的变异源自居群间，71.06%的变异来自于居群内个体间，表明蝉花虫草菌核中核苷类成分居群内个体变异十分丰富。此外，龙良鲲等[23]检测了4个蝉花虫草菌株的产透明质酸情况，其中2个能生成透明质酸，其中编号C1502的蝉花虫草菌株产透明质酸的能力可达 2.45 mg·mL-1。胡海燕[24]测定了不同产地 22 个蝉花虫草菌株产胞外多糖和透明质酸的能力，结果显示，胞外多糖和透明质酸的产量，最高的菌株是最低菌株的3倍。

以上结果显示，蝉花虫草核苷类成分、透明质酸、胞外多糖等次生代谢产物，居群内个体是变异的主要来源，蝉花虫草生化水平具有丰富的多样性，在选取优良菌株用于生产时应重视菌株间的差异。

3.4 核酸水平多样性

目前，关于蝉花虫草基因片段的测序，主要是针对少数个体的片段测序，开展其居群核酸水平多样性研究还很少，相关研究需要进一步开展。曾文波等[22]测定15个居群75个蝉花虫草菌株的ITS片段，并于国际核酸数据库NCBI中下载蝉花虫草ITS序列，共获得蝉花虫草ITS序列100条。比对结果发现，蝉花虫草ITS序列无位点多态性，即在ITS序列中，无种内多样性，核苷酸多样性为0。但是，ITS片段提供的信息有限，关于蝉花虫草核酸水平多样性的研究工作还有待深入开展。

Fan等[25]首次报道了蝉花虫草线粒体基因组，一共测定了3个蝉花虫草菌株，菌株号分别为CCAD02、BA-001、ARSEF11726，线粒体基因组的长度分别为56581bp、56080bp和49138bp，CCAD02的线粒体基因组长度比ARSEF11726的长约7 kb，这是由于CCAD02的线粒体基因组比ARSEF11726多了6个内含子，蝉花虫草线粒体基因组在长度上具有多态性。

蝉花虫草基因组初步分析显示，基因组大小为36.9 Mb，其蛋白编码基因数量以及基因密度远高于蛹虫草、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌等虫草真菌，表明蝉花虫草含有丰富的遗传基因，可能表达丰富的活性物质[3]。

4 展望

结合蝉花虫草的历史记载及虫草类真菌最新系统分类研究进展，确认了蝉花虫草的分类地位，并探讨了蝉花虫草的遗传多样性，以避免混乱，为今后开展蝉花虫草的研究、开发和利用提供了参考。

蝉花虫草与冬虫夏草含有相似的功效成分，例如多糖、虫草酸、水溶性核苷类成分等，且具有相似的功效及药理作用，例如免疫调节、滋补强壮、改善肾功能、抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化及抗衰老、降血脂、降血糖[26-27]，冬虫夏草生长于海拔3 500 m～5 000 m的高山灌丛草甸带和高寒草甸带，年产量逐年减少，价格最高达30万元/kg，人工栽培技术还有很多问题有待解决[28]，与冬虫夏草相比较，蝉花虫草易于人工培养，栽培成本低，现已实现人工规模化栽培[3]，人工培养蝉花虫草可作为冬虫夏草的代用品，接下来应进一步开展蝉花虫草种质资源收集、基因功能、化学成分、药理作用及功效、产品开发等方面的研究工作。