抗菌肽及其在水产养殖业的应用（二）

文/王玉堂

上接2019年2期

用药指导

四、鱼类抗菌肽的生物学活性与功能

（一）生物活性

鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分。当鱼体受到损伤或受到病原侵袭时，能迅速产生抗菌肽杀伤病原微生物，防御入侵。其合成速度快，在体内扩散迅速而灵活的特点是其它大分子蛋白质（如抗体）和免疫细胞所不具备的。细菌和病毒对水产养殖业的影响越来越严重，而且没有一种有效的药物来抑制病原体的感染，抗菌肽的鉴定和特点日益受到水产养殖业界的重视。编码Ple前肽原的基因组序列已经从刺泥鲽中分离出来，在无毒启动子的控制下成功克隆到载体上，通过这种结构，生物活性的Ple转化到鱼体细胞株上，并持续增长了2年多。对于Ple处理加工、成熟、分泌（通过使用绿荧光蛋白融合技术）的研究，分泌的重组Ple抗菌肽具有很高的抗菌活性（在未经过浓缩的细胞悬液中发现），在此之前没有别的重组Ple抗菌肽或鱼体抗菌肽表达到这种程度。这样一个重组Ple抗菌肽或其它相关抗菌肽的过度表达可能会增加发现新的抗菌药物的机会。张宁应用分子生物学手段和生物信息学手段，通过化学合成从海马体内得到了足量的抗菌肽HKPLP。HKPLP对10种人和鱼类致病或条件致病菌株的活性实验表明，HKPLP对大多数的Gram〈+〉菌和Gram〈-〉菌都敏感，其最小抑制浓度（MIC）大多不超过16μg/mL，对白色念珠菌的MIC为32μg/mL，对铜绿色假单胞菌、副溶血弧菌和鳗弧菌等3株鱼类致病菌的作用较弱。尽管HKPLP对人红细胞有一定的溶血活性，但对大多数测试菌株有效抑制浓度下，溶血活性不超过20%。此外还发现HKPLP对Hela、U251和C6等几种致癌细胞有显著的细胞毒作用，IC〈50〉为18μg/mL～40μg/mL，且该作用发生迅速，可能与海马的抗肿瘤活性有关。

Pan CY.Chan JY等人从鲈鱼鳃中分离得到的Epinecidin-1抗菌肽。鲈鱼Epinecidin-1的多克隆免疫组织化学分析表明，这种抗菌肽和它的抗体局限分布于鳃和小肠内。鲈鱼的2个合成肽g-Ple22-51和g-Ple22-42对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都表现出强烈的抑菌活性。此外，在鲈鱼和罗非鱼体内注射弧菌属vulnificus后，抗菌肽通过处理能够显著增加鱼的存活量，这些结果对于研制鱼类病原感染的预防剂和治疗剂提供了一定的依据，特别是对鱼类的细菌感染中的免疫缺陷起到了改善作用。生长于极地海洋环境的鱼类，其血清具有高水平的抗冻蛋白（AFP）或抗冻糖蛋白（AFGP），能够通过阻止冰晶的形成而降低结冰温度，它成为第二个常用的外源基因，通过转AFP基因以提高受体鱼的抗冻能力。在鲽形目鱼类中发现了分子量较大的抗菌肽，它们具有相似的结构特征，均富含丙氨酸和α-螺旋结构。此分子的发现和对其结构与功能的深入研究，将可促进转抗冻蛋白基因鱼的培育进程。

（二）抗菌肽的功能

综上所述，可将抗菌肽的功能概括为以下几个方面：

一是抗细菌功能。阳离子抗菌肽最显著的功能就是抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及革兰氏兼气性细菌。大多数的阳离子抗菌肽都会与细胞质膜相互作用，从而抑制或杀灭细菌。研究发现，真鲷、虹鳟、斑点叉尾鮰等鱼类的抗菌肽对致病性杀鲑气单胞菌、鳗弧菌、鮰爱德华氏菌、荧光假单胞杆菌和鲁氏耶尔森氏菌等都有较强的杀灭或抑制能力。抗菌肽与细菌相互作用的驱动力主要是因为抗菌肽具有两亲性结构，即亲水区域（与水或带负电荷的残基结合）和疏水区域（与脂质结合），这些结构可以使得抗菌肽很好地与两亲性分子结合，特别是易与负电荷的细胞膜结合，通过破坏膜或使膜通透性增加杀死靶细胞。

二是抗病毒功能。抗菌肽也展示出了抑制病毒感染的能力，主要以阳离子抗菌肽为代表。受影响的病毒主要包括RNA病毒和DNA病毒，但无包膜病毒、猫杯状病毒、艾柯病毒例外。抗菌肽的抗体病毒活性主要与病毒的过程（推测可能是由于抗菌肽与病毒或细胞表面的磷脂结合，从而阻止病毒粒子与宿主细胞的融合）以及病毒包上的病毒外壳蛋白直接作用有关。但是，仅仅根据抗菌肽的二级结构似乎无法对其抗病毒活性进行预测。例如，α-螺旋结构的天蚕素、Clavanins肽和LL-37抗菌肽已被证实几乎不会导致单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）失活，而蛙皮素、Dermaseptin和蜂毒肽却显示出相当强的HSV活性。此外，β折叠肽如预防素、鲎素、宿主防御肽Protegrins以及β转折肽乳铁肽也都表现出了对HSV较高的抑制活性。然而，Protegrin类似物因缺乏一个或两个二硫键而使其表现出不同的抗HSV活性。可见抗菌肽的不同结构表现出不同的抗病毒能力。

三是抗真菌功能。近年来，抗菌肽的抗真菌能力逐渐被人们所认知。最初人们认为抗菌肽主要是参与真菌细胞的裂解过程或干扰真菌细胞壁的形成，从而对真菌产生作用。然而，近年来大量的研究表明，天蚕素、果蝇抗菌肽、线肽素、贻贝素、蝎血素以及人工改造的各种抗菌肽等对真菌都有一定的活性，且抗真菌的机理也是多种多样。值得注意的是，抗菌肽的抗真菌活性往往与其相对丰富的极性氨基酸和中性氨基酸有关，由此推测抗菌肽真菌活性与其猎物的结构密切相关。

四是抗寄生虫功能。抗菌肽对生物体内的寄生虫具有杀灭作用，并对寄生虫在宿主间的传播有预防作用。蛙皮素2是第一个被证明具有抗原虫活性的抗菌肽，可致草履虫肿胀和破裂死亡。一种酰化合成抗菌肽，oct-CA(1-7)-M（2-9）已被证明能够安全地治疗利什曼原虫引发的自然获得性犬利什曼病。抗菌肽的抗寄生虫作用机制尚不明确，推测可能为膜攻击性或胞内杀伤机制。抗菌肽作用于质膜后，损坏质膜形态，形成离子通道或出现暂时性的孔洞，导致膜的完整性破坏和功能丧失，造成细胞崩解或死亡。或是通过影响胞内细胞器、核酸及物质转运等方式干扰细胞的正常代谢过程，从而杀伤寄生虫。

五是抗肿瘤细胞的功能。一些阳离子抗菌肽具有猎物的抗癌功效，对多种肿瘤细胞都表现出强有力的杀伤作用，可诱导肿瘤细胞溶解或凋亡。通常人们将具有抗体细胞的抗菌肽称为“抗癌肽”。目前大量的研究都集中在抗菌肽对宫颈癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞的杀伤作用及剂量相关效应方面。且研究结果表明，大部分抗癌肽对肿瘤细胞的抑制作用具有特异性，而对正常细胞无害，这给抗癌新药物的研发提供了新方向。

六是免疫增强功能。抗菌肽除了抗菌活性，也参与机体的代谢和维持稳定等生命活动。一些鱼可以通过皮肤分泌释放具有毒性兼溶血活性的表面活性物质来预防肉食动物捕杀。如从真鲷上分离到的3种抗菌肽对人的红细胞也具有溶血活性。抗菌肽的免疫增强功能主要表现在促进免疫细胞增殖，提高宿主抗感染能力，调节免疫因子活性，抑制过度炎症反应，激活特异性免疫等。

五、抗菌肽的作用机制

就目前的研究结果，抗菌肽的作用机制大体上有以下几个方面：

（一）抗真菌机制

到目前为止，有关抗菌肽抗微生物的机理研究较多没有定论，普遍认为存在两种机制。一是细胞膜操作机制，认为抗菌肽是通过与细胞膜相互作用改变脂双层膜的构造，使细胞膜的通透性增加，并破坏了细胞膜的完整性，造成细胞膜内外渗透压失衡，细胞内容物外泄而使细菌死亡。该机制存在4种假说：凝聚模式、穿孔模式、地毯模式、桶板模式。还有研究认为，抗菌肽是通过与细胞膜上的特异受体结合而使细菌死亡。抗菌肽结合到细菌带负电荷的细胞膜上后，必须穿过富含多糖的革兰氏阳性菌的膜表面或富含酸性多糖的革兰氏阳性菌膜表面，这是抗菌肽独有的一种类似穿膜的机制。另一种是胞内操作机制。抗菌肽富含脯氨酸或精氨酸，这两种氨基酸可有效地使抗菌肽穿过细胞膜进入细胞，与脱氧核糖核酸结合，阻止其复制，从而达到杀菌目的。同时，抗菌肽还可以抑制肽聚糖、核酸和蛋白质的合成，造成细胞的损伤，进而发挥抑菌或杀菌作用。部分抗菌肽还可能会作用于线粒体，阻止线粒体细胞膜质子梯度的形成，进一步使细胞ATP的合成受阻，导致细胞死亡，这对真菌等真核细胞尤为有效。

（二）免疫增强机制

诸多研究表明，抗菌肽具有调节机体免疫活性的生物学功能。抗菌肽能够抑制过度炎症反应，主要是通过直接中和脂多糖（LPS）和抑制生物炎症因子的产生。它还可诱导肥大细胞发生脱颗粒作用，释放组胺和前列腺素D2，引起血管舒张而导致血液中免疫细胞的释放。抗菌肽LL-37通过LPS受体复合物的集合以及受体CD14、Toll样受体（TLR4）和酸化的应激活化蛋白激酶（JNK）来阻止LPS诱导的内皮细胞凋亡。大量研究认为，抗菌肽是通过调节某些生长因子与其受体的表达，激活机体相关信号通路，充当单核细胞和中性粒细胞等免疫细胞的趋化因子，与动物非特异性免疫协同作用来增强机体免疫力，从而对机体起到保护作用。还有研究表明，抗菌肽还能启动和调节特异性免疫，注射蛋白转导域（PTd）和抗菌肽HH2-CpG可以提升免疫球蛋白G（IgG）的分泌水平。抗菌肽LL-37与自身DNA形成复合体，进而通过Toll样受体9（TLR9）信号通路激活浆细胞样树突状细胞（DC细胞），引起干扰素-γ（IFN-γ）的产生与自免疫型T细胞的激活，表明抗菌肽可以通过特异性受体激活免疫细胞功能。

（三）屏障保护机制

对于水生动物而言，非特异性免疫远重要于特异性免疫，因为水生动物的屏障作用是保护水生动物生命安全的第一道防线。近年来许多的研究表明，很多水生动物的上皮细胞均可表达抗菌肽，抗菌肽可以通过多种信号途径参与机体免疫调节，提高角质层形成细胞功能，从而提高机体对病原微生物的抵抗防御能力，即抗菌肽在水生动物黏膜的皮肤防御方面起重要作用。

其作用机制就在于抗菌肽可以调节控制紧密连接蛋白质，相邻细胞间的这些蛋白质的相互作用是紧密连接发挥防御功能的基础，该过程涉及多个信号通路和相关因子。抗菌肽LL-37既可以提高紧密连接蛋白质Occludin的表达，也可以通过对Ras相关的C3肉毒素底物1（Rac1）的调控来加强细胞屏障功能。蛇源抗菌肽Cathelicidin-BF（C-BF）可以通过应激活化蛋白激酶（MAPK）信号通路提高紧密连接蛋白质ZO（zonula occludens proteins）和Occludin的表达，增强屏障功能，保护机体屏障结构的完整性。

鱼类抗菌肽的种类和数目繁多，在鱼的体表黏膜、皮肤、鳃、血液、血清、小肠和肝脏等组织中都分离得到抗菌肽。同种鱼的不同组织可能产生不同类型的抗菌肽，不同鱼的抗菌肽分子结构和作用机制差异也较大。因此，有关鱼类抗菌肽的功能机制还需要大量研究才能揭示。