药品微生物检验用菌种保藏方法

徐莹

（澳诺（中国）制药有限公司 河北保定 071000）

1 前言

菌种保藏作为药品微生物检验的重要内容，技术人员在菌种保藏过程中，需要根据菌种的特性以及设备条件之间的差异合理地选择菌种保藏方法，从而确保菌种的纯度和活性满足研究和药品检验的实际需求，为药品微生物检验工作的顺利开展提供保障。

2 菌种保藏的原理

微生物菌种保藏方法主要是应用微生物的生理及生化特点之间的差异性，人为地创造缺氧、低温、干燥条件，以降低微生物的新陈代谢，保证微生物的生命活动处于停滞、休眠状态，以保证停止生长、繁殖的微生物中的遗传物质具有较强的稳定性[1]。因此，微生物在这一状态下能够保持稳定，进而满足维持种系的目标。现阶段，菌种保藏方法主要有2种：（1）基质中的低温保藏方法。该方法主要有斜面保藏法、半固体穿刺保藏法、石蜡保藏法、沙土管保藏法等。其能够应用降低温度、缺氧、减少养分供给的方式，减少微生物的新陈代谢，实现长期保藏菌种的目标。（2）保温剂中的超低温保藏，如真空干燥冻存法。这种方法主要是应用保护剂的方式，减少溶液结晶，实现微生物细胞内外渗透压的有效平衡，更好地保存微生物，并将温度降低到实际冰点位置，确保微生物的新陈代谢全部停止，这种方式操作具有一定的复杂性，但对硬件条件的要求比较高，能够长期保存菌种，具有较高的稳定性。

3 药品微生物检验用菌种保藏方法

3.1 斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是一种常用的保藏方法，这种方法的主要内容是在操作过程中，将菌种培养到斜面培养基中，在菌种覆盖整个斜面后，将菌种放置温度为4℃的冰箱中进行冷藏，一段时间后，使用相同的方式对菌种进行转培养，这种方式适用于多种菌种的短期保藏中，其具有操作简便、设备要求低、菌种存活率高等优势[2]。但是，这种方式的保存时间只能持续1～6个月，不适用于长期保藏的菌种中，温度需要控制在约4℃。通常情况下，菌种具有一定的代谢水平，能够有效降低菌种的活性，但采用反复的菌种培养方式，会使得菌种出现变异问题，进而被感染。

3.2 石蜡油封藏法

石蜡油封藏法的主要原理是使用无菌处理和蒸发的方式去除培养成熟菌种斜面中的水分，然后使用石蜡封闭斜面，确保石蜡厚度高出培养斜面顶端约1 cm，这样培养出的菌种能完全隔绝空气。在封存完毕后，需要使用硅胶、固体石蜡等材料封住口部，将其垂直排放在温度为4℃的冰箱中。这种方式的应用不仅能满足低温、阻隔氧气的作用，还可以降低培养菌种的活性，延长菌种保存时间，适用于保存期在1～2年的菌种中。

3.3 冷冻真空干燥保藏法

冷冻真空干燥保藏法的原理是将包含菌种的悬液倒入保存瓶中，使其在低温环境中快速凝冻，并放在低空状态下抽成真空，使其中的水分升华，留下干燥的固体菌种，随后将处理完的菌种保存在低温环境中，使其处于休眠状态，以便于长期保存。冷冻真空干燥保藏法需要充分考虑低温、干燥、阻断氧气等因素，其具有保存时间长的优势，能够持续保存5～15年，且菌种不易变异，具有较高的存活率，适用于需要长期保存的菌种，且无需占据很大的保藏空间。但是，这种方法的操作过程相对复杂，需要引进较先进的技术、冻干机等设备。

3.4 定期移植法

定期移植法的主要原理是将菌种接种到适宜的环境中培养，避免因环境的改变导致菌种的遗传物质、形状发生变化，在生长充分后，保存在4～6℃的环境中进行传代培养，其保藏时间需要根据菌种、微生物的差异进行选择。定期移植法具有操作简便、便于提取等优势，往往需要移种进行培养。在培养过程中，微生物和菌种会接触外部环境，从而影响菌种的排异功能，且需要长期保存，这种保藏方法需要投入大量的人力和资金，因而在实验需要、特殊要求的情况下，可以使用此方式。

3.5 沙土管保藏法

用吸铁石去除河沙中的铁质，并浸泡在10%的盐酸中，浸泡24 h后，将其清洗至中性，并进行烘干备用，还要选取地表以下40～60 cm深度的非耕作、贫瘠的低黏性土，将其研碎过筛，清洗至中性，并进行烘干备用。另外，将处理后的河沙和土质按照2∶1的比例进行混合，将其放入试管中，高度约1 cm，并使用棉塞进行密封处理，随后进行湿热灭菌，无菌检验合格后可以使用。沙土管保藏法在检验合格后密封保藏在4～6℃的冰箱中，每隔6个月验证一次，这种方法具有简便的优势，用于产孢子和有芽孢的菌种保藏，可保存2年，但对营养细胞不适用。除此之外，在真空干燥过程中，保藏放线菌和部分真菌的孢子时最好用干法接种。

3.6 液氮冷冻保藏法

首先，将菌种制作成悬液备用；其次，清洗并烘干安瓿瓶；最后，在安瓿瓶中装入冷冻保护剂。在选择保护剂的过程中，相关人员需要充分考虑被保藏微生物的类别，每瓶需要注入10%～20%的甘油，并塞上棉塞，随后放入高压锅中，在1.5 kg/cm2的压力下灭菌30～45 min，检查无菌后接入菌种，火焰熔封瓶口，并将封闭的安瓿瓶放入冻结器中，保证冷冻速度在1 min内下降1℃，冻结到-35℃，将冻好的安瓿瓶放在-196～-150℃的液氮罐中进行保藏，这种方法不仅适用于一般微生物的保藏，还适用于冷冻干燥法中无法保存的微生物，如支原体、衣原体等，这种方法的应用不会改变菌种的形状，但设备的价格比较高。

4 药品微生物检验用菌种保藏方法的特点

药品微生物检验用菌种保藏方法中常用的是斜面低温保藏法，保存难度大、要求高的方法是冷冻真空干燥保藏法。在现代化社会的发展中，各个行业的技术水平在不断提升，很多先进设备融入菌种保藏的过程中，使菌种的保存期限越来越长。但是，药品微生物检验用菌种保藏方法都具有自身的特点，相关人员需要根据菌种保藏目的的差异性，合理地选择保藏方法。同时，由于各个菌种的特性存在一定的差异，在实际保藏过程中，技术人员需要在分析菌种特点的基础上，合理地选择保藏方法。

5 结语

在选择菌种保藏方法的过程中，相关技术人员需要充分了解菌种的相关内容，合理地选择保藏方法，确保菌种的活性和纯度，充分发挥菌种在微生物实验中的作用。此外，在现代化的发展中，技术人员需要积极引进先进的技术和经验，探索菌种保藏方法，将菌种保藏方法更好地应用到药品微生物检验过程中，保证菌种具有原有的活性和纯度，实现研究的准确性、可靠性，为药品微生物检验工作的顺利开展提供保障。