分子标记技术在甘草中的应用△

李珍珍，郑司浩，尚兴朴，邓庭伟，王继永*，赵润怀*

1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.中国中药有限公司，北京 100195

甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.(也称乌拉尔甘草)、胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根茎，又名国老、灵通、甜草、棒草[1]。甘草性味甘平，具有清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和药性等作用[2]。随着中医学科的应用普及，国内外都对甘草的药理作用进行了非常广泛和深入的研究[3-10]。但不同基原甘草的有效化学成分含量有显著的差别，且同一基原不同产地甘草的有效成分也存在差异[11-16]。

随着分子生物技术在农作物和中药领域的迅速发展及应用[17-20]，其对甘草的基原鉴定以及遗传多样性的研究层出不穷。相对于甘草传统鉴定方法，如形态鉴别、显微鉴别、理化鉴别、红外鉴别、指纹图谱鉴别等[21-24]，分子标记技术显示出迅速准确的鉴别效果；而在甘草的遗传多样性上，不同的分子标记又各具特点，本文将对分子标记在甘草中的应用做出综述。

1 分子标记技术概述

分子标记技术是研究反映生物个体、居群以及物种等分类单位间的基因组DNA片段差异的技术，广泛应用于生物基因组探究、生物分子鉴定、生物遗传等研究领域。分子标记的种类主要有：基于Southern杂交技术的分子标记如RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段长度多态性)、基于PCR的分子标记如RAPD(randomly amplified polymo-rphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplification fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeat，简单重复序列)、ISSR(inter-simple sequence repeat，内部简单序列重复)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism，序列相关扩增多态性)、基于DNA序析的SNP(single nucleotide polymorphism、单核苷多态性)及DNA条形码(DNA barcoding)等。

2 分子标记技术在甘草中的应用

2.1 RFLP

RFLP是20世纪70年代发展起来的分析DNA片段的技术，既能检测基因组DNA(genome DNA)，又能够检测核糖体DNA(ribosome DNA，rDNA)以及叶绿体DNA(chloroplast DNA，cpDNA)，结果较稳定，而且是共显性表达。RFLP多应用在鉴别菌落和研究菌落的多样性[25]。谷俊等[26]采用表型数值分类、16SrDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析，结果表明，菌株表现出丰富的遗传多样性。

2.2 RAPD

RAPD技术不需要专门设计序列的引物，且引物的Tm值比较低，能保证寡聚核苷酸引物与模板稳定结合，允许引物和模板适当误配，因此增大了引物在基因组DNA中配对的随机性，提高了对DNA的分析效率。王鸣刚等[27]以不同地区的3种15组甘草(Glycyrrhizauralensis、G.infleta、G.glebra)种子为材料，研究RAPD分子标记在甘草亲缘关系中应用的可行性，结果显示，根据RAPD聚类分析方法得出15组甘草植物之间的亲缘关系与形态学分类结果存在差异。吴霞等[28]应用RAPD技术探讨新疆产甘草不同地理群体的遗传多样性，此研究证明了同一产地栽培种与野生种具有相似的遗传特性，反应了地理环境对遗传特性有一定的影响，为不同产地甘草的遗传特性比较提供了理论基础。陆嘉惠等[29]应用RAPD技术，探讨甘草属(GlycyrrhizaL.)13种1变种30个植物类群的遗传差异和几个争议种的分类地位，结果显示，基于RAPD图谱建立的系统发育图与经典分类学有较好的一致性，由此说明RAPD标记可为甘草属的系统分类探究提供分子生物学依据。张增福等[30]以甘草种质为试材，采用正交试验法设计，对影响RAPD-PCR扩增的主要因素dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板进行优化筛选，建立了适合甘草分子研究的RAPD-PCR反应体系，为不同产地甘草种质的分子学研究提供方法依据。以上研究可见RAPD技术在甘草遗传多样性和分类学上起着重要的作用。

2.3 AFLP

AFLP同时具有RFLP技术与PCR技术的优点，即可靠性和高效性。周成明等[31]采用AFLP标记技术研究4个来源甘草属植物的遗传基础，初步探讨了AFLP在甘草品系选育中的应用，结果显示，“民勤1号”“喀什1号”“阿克苏1号”形成了独特的基因构成，为乌拉尔甘草优良栽培新品种选育研究奠定基础。葛淑俊等[32]利用AFLP分子标记对甘草主产区的16个野生种群320个单株进行遗传多样性研究，建立了适合野生甘草遗传多样性分析的稳定的AFLP体系，筛选出15对引物组合对16个种群320个单株共扩增出759条谱带。根据各指标显示，遗传多样性水平从高到低顺序为宁夏、内蒙古、新疆、黑龙江、山西、甘肃酒泉，此研究得出的信息为甘草遗传多样性的保护和品种选育研究提供参考依据。杨全等[33]采用cDNA-AFLP(cDNA amplified fragment length polymorphism)[34]方法分析8种变异类型甘草基因表达的差异，获得14条差异表达基因片段，并首次克隆了不同变异类型甘草特异表达的基因，筛选出了优良变异类型，为新品种选育奠定基础，同时为甘草功能基因的研究累积参考数据。

2.4 SSR

1974年，Skinner等[35]发现了结构为-(-T-A-G-G-)n-(A-T-C-C)n的重复序列。后来研究发现，这种重复是真核基因组特有的，并称之为“简单重复”。在众多分子标记中，SSR多态性丰富、数目多、分布均匀、具有共显性以及符合孟德尔遗传等优点，且结果稳定[36-39]。已在许多农作物的起源、遗传图谱建立、多态性分析、品种鉴定以及辅助育种等方面有了广泛的应用，并且此技术稳定可靠。刘越等[40]在乌拉尔甘草中开发功能性EST-SSR分子标记，分析乌拉尔甘草EST-SSRs特征，为乌拉尔甘草EST-SSR的遗传分布规律提供参考，也为进一步开发乌拉尔甘草功能性EST-SSR标记奠定了基础。李晓岚等[41]通过乌拉尔甘草表达序列标签(EST)数据库搜索甘草属的SSR位点，并使用Primer3.0软件设计引物，分析来自甘草属4个种22份材料的EST-SSR指纹图谱特征和聚类结果。结果表明，实验中开发的15对引物对甘草属具有很好的适用性，为甘草的种间亲缘关系、种内遗传多样性研究以及物种鉴定等提供分子依据。刘亚令等[42]采用正交设计试验建立了适合甘草SSR-PCR反应的最佳体系，利用优化体系对69对SSR引物进行了筛选，共筛选出33对在4种药用甘草中均能有效扩增且多态性较好的SSR引物，为利用SSR标记对甘草属植物的遗传多样性分析、分子辅助育种、指纹图谱构建和物种鉴定及野生资源保护等工作提供技术支撑。

2.5 ISSR

简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)也称锚定简单重复序列(anchored inter-simple sequence repeat，ASSR)，是以微卫星为引物的PCR(microsatellite-primed PCR，MP-PCR)，或是在SSR基础上发展起来的，用SSR为引物扩增重复序列之间区的DNA分析技术。ISSR采用的引物具有更强的专一性，与模板结合的强度提高，重复性好，并可揭示比RFLP、RAPD、SSR更多的多态性，此技术结合了RAPD标记技术与SSR标记技术的优点，耗资少，模板用量少，不需要知道靶标序列的SSR背景信息，使用通用引物。孙群等[43]利用ISSR分子标记技术对不同种源乌拉尔甘草的遗传多样性进行分析，结果表明，新疆地区乌拉尔甘草遗传多样性最为丰富，其次是西北地区，最低的为东北地区，并证明了基于ISSR分子标记划分的组群与地域性没有明显关系。李贝宁等[44]采用ISSR分子标记技术研究来自4个产地155个甘草个体的遗传多样性，结果表明，各产地野生品基本都能够各自聚为一类，内蒙古、宁夏和甘肃甘草遗传特征较为稳定，陕西甘草的变异幅度较大，说明不同道地产区甘草的遗传多样性具有显著的地域性特征，且甘草道地药材的形成具有遗传基础。

2.6 DNA条形码

DNA条形码是利用具有足够变异的短基因片段对物种进行准确快速鉴定生物身份的识别系统，能够快速有效率地鉴别物种，因此得到非常广泛的应用。刘春生[45]在研究3种药用甘草的ITS序列中发现胀果甘草和其他甘草种类有1个碱基差异，乌拉尔甘草和其他甘草种类有3个碱基差异，并筛选出2个上游引物，成功鉴别了乌拉尔甘草和胀果甘草。陈士林[46]发表了3种药用甘草的ITS2序列峰图以及条形码consensus序列及种间序列变异情况，提出将ITS2序列作为甘草的通用DNA条形码序列。赵月梅等[47]分析了刺果甘草与甘草、苦参、黄芪基原植物编码核糖体RNA的核基因的ITS2序列的K2P距离，且基于K2P距离构建了系统进化树，都证明了ITS2序列可以准确鉴定这几种药材以及不同基原植物，为甘草等药材及其混伪品的鉴别提供了新的研究方法。杨瑞等[48]利用PCR扩增得到了长度为616 bp的ITS序列和389 bp的psbA-trnH序列，在ITS序列中找到4个变异位点，且确定了2种ITS单倍型，在psbA-trnH序列中找到3个变异位点，并确定了4种psbA-trnH单倍型，结合ITS和psbA-trnH两个序列的分析，确定了3种基原甘草的分子鉴定方案。

2.7 其他分子标记在甘草中的应用

分子标记技术种类很多，除了以上常见的分子技术外，也有很多用其他方法对甘草做出了研究和探讨。艾鹏飞等[49]采用四因素(Taq酶、Mg2+、dNTP、引物)四水平的正交试验设计[L16(44)]对甘草进行SRAP-PCR试验，电泳结果采用软件SPSS分析，退火温度和引物筛选采用单因子试验，优化了SRAP-PCR，反应体系为进行甘草资源遗传分析提供了技术支持。宋凤等[50]采用SCoT、EST-SSR分子标记对甘草属8个自然居群的14个4种1变种个体进行基因组DNA的多态性检测，结果表明，SCoT和EST-SSR两种标记均可揭示甘草属种间与种内的遗传多样性水平以及亲缘关系，是进行甘草属植物自然群体的遗传结构、种间基因渐渗等研究的有效分子标记。其中，SCoT标记多态性高，信息量大，更适于甘草属植物种质资源的遗传多样性分析，个体间遗传差异检测上EST-SSR标记效果更佳，更利于疑难种鉴定及亲本分析。沈湛云等[51]采用RT-PCR技术，扩增出甘草bAS编码区序列，运用DNAman分析软件找出此序列的SNP位点，分析了甘草β-香树酯醇合成酶(β-amyrin synthas e，bAS)编码区SNP与甘草酸含量之间的相关性。臧艺玫等[52]采用PCR-SSCP和测序组合技术检测了6个产地甘草的β-香树脂醇合成酶(β-AS)基因的SNP，探索了甘草道地性形成的分子机制，结果证明了甘草β-AS基因94位点的SNP可能是导致甘草道地性形成的机制之一。

3 展望

由于甘草作为大宗药材之一，应用广泛，需求量很大，人们大量无节制采挖导致野生甘草资源遭到严重破坏，人工甘草将成为野生甘草的重要替代资源，导致各地方甘草的种植非常混杂，种源信息不明，影响着甘草的质量评价[53]。近年来，分子标记技术对甘草的道地性研究、品种鉴定、遗传多态性分析等方面的研究层出不穷，为甘草基因上的研究做出了很大的贡献[54]。但在利用此技术研究甘草时会有两个问题，一是分子技术的重现性和稳定性；二是实验样品的理想性，即甘草样品收集时会出现种源信息不准确，这些问题严重影响着实验分析结果和结论。为了得到全面准确的结果，已有研究者通过多种方法同时对同一种中药材进行研究[55-56]。目前，对甘草的分子标记的引物设计及其反应条件都在不断地改善[33，53]，不管是研究样品资源的收集还是技术的改进都具有进一步的发展价值。