实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中的运用

2019-01-06韩笑

中国畜禽种业 2019年5期

韩笑

（山东省临沂市河东区畜牧兽医局太平畜牧兽医站 276029）

1 实时荧光PCR技术在动物疫病诊断的应用优势

首先，实时荧光PCR 技术可在同一个反应中同时加入多对引物，显著提高客PCR 配对的效率，不同的荧光分子对引物进行标记，探针或者是荧光染料等发出的信号，会被自动化仪器接受，这样一来即使是在一次反应中也能同时对多个靶基因进行实时定量检测，撇开检测效率不谈，单就定量检测就能快速进行病原体混合感染的筛选，因此，被广泛应用在临床病原体筛选中。其次，实时荧光PCR 技术中多了荧光探针或是荧光染料，可以在PCR 反应过程中直接检测荧光信号的变化，实现靶基因定量检测以外，可提高扩增特异性，缩短检测时间，因为是自动化仪器收集荧光信号[1]，能提高实验的灵敏度，不仅实现了定性到定量的飞跃，还实现了检测质量和检测时间的全面提升。最后，由于实时荧光PCR 技术日渐成熟，应用中退出了荧光PCR 试剂盒，这种试剂盒的推广改变了以往的实验，因为荧光PCR 技术是全封闭无反应，不需要进行后续的PCR 处理，显著避免实验污染，提高实验结果的分析价值，这一优势也极大加快了荧光PCR技术在动物疫病诊断的应用。

2 实时荧光PCR技术在动物疫病诊断实际应用

2.1 诊断病毒病

荧光PCR技术在动物疫病诊断实际应用中，诊断病毒病是最常规的应用，以往PCR 技术也用于诊断病毒病。其中最为常见的就是禽流感，禽流感已成为每年都会出现一次的疾病，现如今禽流感已有16 种血凝素HA 亚型，禽流感病毒是世界性分布病毒，多数感染都是隐性感染[2]，临床症状多于感冒相似，在感染初期没有特异性的表现，只有极少数禽流感病毒具有快速传播和高致病性的特性，国内外监测流感性病毒的方法一般是利用鸡胚病毒分离方法，但这种检测方法耗时太长，不符合临床研究及实验要求，也不利于禽类进出口检疫的诊断。利用实时荧光PCR 技术检测诊断病毒病，将检测时间从以往的21d缩减到4h，依据张鹤晓的A 型流感病毒实验，建立“一步法”检测流程后，直接对A 型流感病毒的核算保守区共有序列筛选敏感性及特异性的引物，直接检测所有A 型流感病毒的通用型荧光PT—PCR。利用这种方法能在保持敏感性的前提下缩减检测时间，直接对泄殖腔、喉拭子和禽肉进行检测。由此可见，实时荧光PCR 技术可显著缩减病毒病的检测时间，并且保证实验结果及实验敏感性。

2.2 新城疫

新城疫的检测属于副黏病毒，以往检测也是利用鸡胚病毒分离方法，但这种方法可以检测其病株的致病性，难以明显反应其毒株的致病力，检测时间也需要21d。建立荧光PT—PCR方法进行形成以病毒的检测，可以显著分离中强毒和弱毒区，还可以避免与常见禽类病毒进行交叉反应，将免感性提高到10-7，显著提高新城疫的检测结果准确性。所以，荧光PCR 技术在新城疫检查中具有较强的优势。

2.3 反刍动物疫病

反刍动物疫病与一般的动物疫病诊断不同，近年来，我国牛羊养殖业快速发展，国际之间的牛羊进出口量增多，疫病监测等存在较大缺陷，导致牛疫病新旧疾病困扰着养殖业发展，由于不少牛病会影响人体健康，加强反刍动物疫病检测也是目前荧光PCR 技术的主要应用领域。实时荧光PCR 技术通过双探针能实现一步多重荧光RT-PCR 检测，同时对多种牛病毒和边界病毒进行检测，且检测敏感度能达到4.8 个TCLD50，这种方法也可以用于羊边界病毒的检测。WernikeK 就是利用Bo-HV-1 糖蛋白gD 和gE 基因的引物作为检测标准，建立三重荧光PCR 方法检测与鉴别BoHV-1 疫苗株和野毒株，这种检测方法的敏感度高达10 个反应。多重检测方法可以达到单重检测的效果，显著加快检测效果及检测范围。