酶联免疫斑点法在重症药疹致敏药物鉴定中的应用

高雪梅 章星琪 王芳

中山大学附属第一医院皮肤科，广州510080

药疹是药物通过注射、内服、吸入等途径进入人体后引起的皮肤黏膜急性炎症反应。重症药疹是一类病情危重的药疹的统称，主要包括Stevens-Johnson 综合征/中毒性表皮坏死松解症（SJS/TEN）、剥脱性皮炎型药疹、伴嗜酸性粒细胞增多和系统症状的药物反应（drug reaction with eosinophilia and systemic symptoms，DRESS）、急性泛发性发疹性脓疱病（acute generalized exanthematous pustulosis，AGEP）。重症药疹除皮损泛发之外，常伴有发热等全身中毒症状及多脏器损害，病死率可高达40%[1]。对于重症药疹的诊治和预防，明确致敏药物并及时停用和避免再次暴露是关键。

目前对于临床工作中遇到的药疹病例，临床医生主要依靠病史和药疹潜伏期判断致敏药物，而在患者同时服用多种药物且病史回忆欠准确的情况下，传统的判断方法往往有失准确。致敏药物的实验室鉴定方法分为体内试验和体外实验，其中，体内试验包括皮内试验、斑贴试验和药物激发试验；体外实验包括嗜碱性粒细胞脱颗粒实验、淋巴细胞转化实验（lymphocyte transformation test，LTT）、药物诱导细胞因子释放实验如酶联免疫斑点法（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）等[2]。对于重症药疹，体内试验有再次诱发疾病的可能性，因此较难开展；在体外实验中，与LTT相比，ELISPOT是新的实验方法，具有较高的灵敏度和特异度，近年已有不少利用ELISPOT 鉴定重症药疹致敏药物的报道，我们就ELISPOT 在重症药疹致敏药物鉴定中的应用做一综述。

一、重症药疹发病机制及ELISPOT检测原理

目前研究证实，重症药疹的主要发病机制为T 细胞介导的迟发型超敏反应[3]。药物抗原初次进入机体后，可通过以下四种方式完成抗原提呈过程：①经典的抗原提呈过程；②结合抗原提呈细胞表面的主要组织相容性复合体分子；③结合特定人类白细胞抗原（HLA）后被抗原提呈细胞识别；④直接非共价结合T细胞受体[4]。抗原提呈的最终结果是效应T 细胞被活化，并形成药物特异性记忆T 细胞[3]，该记忆T细胞可在机体内存活十余年[5]，当机体再次暴露于相同的药物抗原，记忆T细胞可迅速活化，通过分泌大量细胞因子如干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、趋化因子配体9（CXC chemokine ligand 9，CXCL9）、CXCL10、白细胞介素4（IL-4）和IL-5以及细胞毒性蛋白如颗粒溶素、穿孔素等[1，6]，引发严重的免疫反应，临床则表现为皮肤黏膜红肿、水疱、坏死剥脱，甚至内脏器官损伤。

1980年代，Czerkinsky 等[7]首次提出 ELISPOT，它通过在体外检测单细胞分泌的细胞因子来判断被检测细胞是否活化。因为药物特异性记忆T细胞可在重症药疹患者体内长期存活，所以可分离患者的外周血T细胞，在体外用可疑药物进行刺激，如果加入的是致敏药物，则T细胞会被活化并分泌细胞因子，利用ELISPOT 技术检测细胞因子可判断T细胞是否活化，进而确定致敏药物。具体过程是：在聚偏二氟乙烯为基质的培养板上，预先包被特异性抗体，加入药疹患者的外周血单个核细胞和可疑药物或其衍生物共同孵育，在药物抗原的刺激下药物特异性T 细胞能分泌多种细胞因子，后者可被膜上的特异性抗体捕获，经标记显色，在孔底部形成点状聚集，根据形成的斑点数来判定结果。与LTT 相比，ELISPOT 能够检测单个细胞分泌的细胞因子，从而大大增加检测敏感度。

二、ELISPOT在重症药疹的应用

SJS/TEN 中效应性T 细胞和自然杀伤细胞分泌的炎症因子主要有穿孔素/颗粒酶B（GrB）、颗粒溶素、IFN-γ、TNF-α 等[8]，因此，以往学者在 SJS/TEN 患者中应用ELISPOT 时，主要检测的细胞因子为 IFN-γ、IL-4 和 GrB。Polak 等[9]选择 9 例 SJS/TEN 患者分别运用 ELISPOT 法及LTT法进行致敏药物鉴定，结果显示7例IFN-γ ELISPOT 阳性，4 例 IL-4 ELISPOT 阳性，5 例 LTT 阳性，可见，IFN-γ ELISPOT 的敏感度比 LTT 高。Haw 等[10]也比较了 LTT 与ELISPOT 筛选SJS/TEN 患儿致敏药物的敏感度，发现4 例SJS/TEN 患儿 IFN-γ ELISPOT 全部阳性，1 例 IL-4 ELISPOT阳性，2 例 LTT 阳性。Klaewsongkram 等[11]对 11 例别嘌醇致SJS/TEN的确诊病例通过IFN-γ ELISPOT确定致敏药物，结果显示IFN-γ ELISPOT敏感度为73%。以上结果表明，在运用 ELISPOT 对 SJS/TEN 进行致敏药物检测时，IFN-γ 较 IL-4更为合适，这也和SJS/TEN的发病机制相一致[9]。也有研究者通过 ELISPOT 测定 GrB 筛选致敏药物。Porebski 等[12]应用不同方法对15 例SJS/TEN 确诊病例进行致敏药物鉴定，结果显示GrB ELISPOT 的敏感度为33%，特异度为98%，而采用流式微珠阵列技术检测IFN-γ的敏感度为55%，通过流式细胞仪检测CD4+T 细胞分泌的颗粒溶素的敏感度为53%，3 种方法联合检测的敏感度可达80%，而LTT 的敏感度仅为27%。

既往文献显示，颗粒溶素是SJS/TEN 中导致角质形成细胞凋亡的关键介质，它与疾病的严重程度呈正相关[13-14]；研究显示，SJS/TEN 患者外周血中IFN-γ 诱导的趋化因子CXCL9 和 CXCL10 均升高[6]，SJS/TEN 患者外周血和水疱疱液中 TNF-α 异常升高[15]。因此，笔者认为颗粒溶素、CXCL9、CXCL10和TNF-α均有潜力成为用ELISPOT判断致敏药物的检测指标。同时，应用ELISPOT 联合检测多种细胞因子或细胞毒性蛋白，极有可能进一步提高检测敏感度。

除 SJS/TEN 外，研究者还将 ELISPOT 应用于 DRESS 患者 。Klaewsongkram 等[11]对 13 例明确由别嘌醇致敏的DRESS 患者通过IFN-γ ELISPOT 确定致敏药物，结果显示IFN-γ ELISPOT 敏感度为 69%。Polak 等[9]应用 ELISPOT 和LTT 法对7 例DRESS 患者进行致敏药物鉴定，IFN-γ ELISPOT 5例阳性，IL-4 ELISPOT 4例阳性，而LTT法1例阳性。Haw 等[10]应用 LTT 法、IFN-γ ELISPOT 和 IL-4 ELISPOT对5 例DRESS 患儿筛选致敏药物，结果显示2 例IFN-γ ELISPOT阳性，而5例IL-4 ELISPOT阳性，2例LTT阳性。由此可见，对DRESS致敏药物的检测，ELISPOT敏感度也高于LTT。有趣的是，与SJS/TEN 不同，对DRESS 患者应用IL-4 ELISPOT筛选致敏药物敏感度比IFN-γ ELISPOT高，可能与DRESS 患者中Th2 型细胞因子（包括IL-4、IL-5）占优势有关[5，16]。

值得注意的是，获得性免疫缺陷综合征（AIDS）患者在抗病毒治疗过程中出现重症药疹并不少见，携带HLAB*57：01 基因与抗病毒药阿巴卡韦致药疹有关，但HLAB*57：01 基因的阳性预测值只有 55%[17]。虽然 HIV 病毒感染使机体免疫功能部分或完全丧失，致敏T 淋巴细胞只产生少量细胞因子，但ELISPOT 法仍能有效鉴定出此类患者的致敏药物。Esser 等[18]对接受阿巴卡韦治疗的HIV 患者进行研究，其中5 例为HLA-B*57：01 阳性并明确为阿巴卡韦致敏患者，12例为HLA-B*57：01阴性的可疑阿巴卡韦致敏患者，结果显示5 例HLA-B*57：01 阳性患者IFN-γ ELISPOT 全部阳性；而 12 例 HLA-B*5701 阴性患者中 5 例IFN-γ ELISPOT阳性。虽然缺乏与其他实验方法的对照，该研究仍然提示，应用ELISPOT法鉴定AIDS患者的致敏药物具有可行性，若能同时联合基因检测，则有可能进一步提高阳性预测值。

三、ELISPOT的影响因素

1.试验时机的选择：既往研究者普遍认为体外实验如LTT 应选择在疾病的恢复期进行，而ELISPOT 的应用时机较为灵活，可在重症药疹病程早期进行[1]。Polak 等[9]研究表明，迟发型药物超敏反应患者在疾病的急性期进行ELISPOT阳性率较高。Haw等[10]应用ELISPOT对16名药疹患儿进行致敏药物鉴定，共收集不同患儿的7份急性期（发病30 d内，平均发病时间6 d）和7份恢复期（平均发病时间185 d）血标本，另外选取2名患儿分别收集急性期与恢复期的血标本，发现应用ELISPOT 检测药物特异性T 细胞分泌的细胞因子尤其是IL-4 的敏感度在急性期（IL-4 ELISPOT 100%，IFN-γ ELISPOT 88.9%）比恢复期（均为66.7%）高。因此，为了提高敏感度，在重症药疹发病30 d 内进行ELISPOT较为适宜。

2.受试药物：ELISPOT 实验结果与药物致敏原的选择以及药物浓度有关。在体外实验中，由于无法模拟药物体内代谢过程，难以形成完全抗原激活T细胞，因此可能无法得到阳性结果。目前关于迟发型超敏反应介导药疹的抗原提呈机制在不断发展，有些药物如卡马西平，可直接激活T细胞[4]，这一不依赖完全抗原的T细胞激活过程可能预示着ELISPOT将有更广泛的应用空间。

如何选择ELISPOT 中的药物浓度尚没有统一的结论，设定原则是根据患者的治疗浓度、药代动力学综合推算，同时设置从低浓度开始的至少3个浓度梯度。有研究者观察1 名万古霉素致敏的药疹患者在不同药物浓度下IFN-γ ELISPOT 反应情况，结果显示低浓度时，IFN-γ ELISPOT 阴性，随着浓度增加，IFN-γ ELISPOT 阳性反应增强[9]。这提示受试药物浓度过低易导致假阴性，所以设置不同的药物浓度梯度极为重要。

3.T淋巴细胞的功能：对于合并免疫缺陷疾病或使用免疫抑制剂的患者，T细胞的活化增殖会受到抑制。为解决这一问题，有学者在ELISPOT 中引入程序性死亡配体L1（programmed death-ligand 1，PD-L1）抑制剂。PD-L1 和其受体程序性死亡受体1（programmed death-1，PD-1）的结合能抑制T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌，而PD-L1抑制剂可促进活化的药物特异性 T 细胞分泌 IFN-γ[19]，进而提高ELISPOT 的敏感度。Klaewsongkram 等[11]对 26 例明确由别嘌醇导致的重症药疹（DRESS、SJS/TEN）患者用IFN-γ ELISPOT 检测致敏药物：用不同浓度（10、100 mg/L）的别嘌醇及其活性代谢产物氧别嘌醇进行刺激，并设置加入或不加入PD-L1抑制剂的T细胞孵育环境，结果显示加入PD-L1抑制剂且氧别嘌醇浓度为100 mg/L 组IFN-γ ELISPOT 阳性率最高，总体敏感度为79.2%，特异度为95.2%。也有研究者在IFN-γ ELISPOT 基础上，预先采用CD3/CD28抗体与患者的外周血单个核细胞共孵育7 d，结果显示经过抗体孵育后 IFN-γ ELISPOT 法阳性率明显高于单纯IFN-γ ELISPOT和LTT[20]。这些结果提示，可以通过改善T细胞的活化状态和孵育环境提高ELISPOT检测致敏药物的敏感度。

四、与其他免疫学方法的比较

在体内试验中，斑贴试验安全易行，其阳性反应与药疹类型有关，在某些类型药疹如DRESS、急性泛发性发疹性脓疱病患者有较高的敏感度，而在SJS/TEN 患者敏感度为9%～24%[21-23]。药物激发试验是寻找致敏药物的金标准，但可诱发严重不良反应，具有一定危险性，因而不适用于重症药疹[24]。

体外实验中，LTT 的敏感度在迟发型超敏反应介导的药疹达 60% ～ 70%[25]；在重症药疹 LTT 敏感度为 14% ～73%，特异度82% ～ 100%[9-10，12，26]，因该试验有放射性，结果受多因素影响，不能早期鉴定致敏药物，所以其在临床中的应用受限。而ELISPOT在重症药疹致敏药物鉴定中的总体敏感度为 25% ～ 100%，特异度 95% ～ 98%[9-12，18，20]；在 SJS/TEN 中 IFN-γ ELISPOT 和 IL-4 ELISPOT 的敏感度分别为73% ～ 100%、25% ～ 50%；而对于DRESS，IFN-γ ELISPOT敏感度为40%～100%，IL-4 ELISPOT 敏感度80%～100%，ELISPOT 联合皮内试验敏感度 79%，特异度 100%[27]。因此，不难看出，ELISPOT在重症药疹致敏药物鉴定中敏感度高于LTT。

综上所述，ELISPOT在重症药疹尤其是SJS/TEN致敏药物的鉴定中具有敏感度高和特异度高的优势，但由于目前此项方法的研究较多集中于SJS/TEN 和DRESS，能否应用于其他更常见的药疹类型尚待进一步研究。相信随着技术的改进和发展，ELISPOT 将成为临床医生判断药疹患者致敏药物的可靠工具。