干细胞治疗闭合性不完全肌腱损伤的研究进展

胡 静 李章华

1.武汉体育学院研究生院，湖北武汉 430079；2.武汉大学同仁医院（武汉市第三医院）骨科，湖北武汉 430074

闭合性不完全肌腱损伤在运动和生活中都十分常见，因解剖结构特异和无法自我腱性修复（只能瘢痕愈合）而留有后遗症，给患者及其家庭带来压力[1]。近年来，随着组织工程和基因工程的发展，给肌腱修复带来了希望[2]。干细胞是具有自我复制功能的细胞，一定条件下可分化为多种功能细胞，目前，用于肌腱修复较成熟的有：骨髓间充质干细胞（BMSCs）、肌腱干细胞（TDSCs）和胚胎干细胞（ESCs）[3]。BMSCs 从骨髓中分离出来，具有自我增殖和多向分化能力，特定条件下可向肌腱、骨、软骨等组织分化，是肌腱组织修复的重要种子细胞来源[4]。TDSCs 与肌腱细胞类似，经TDSCs 修复的肌腱很大程度上满足了肌腱的力学要求，是很多高水平运动员的首选[5]。ESCs 是分化肌腱组织的原始细胞，其“再生记忆功能”能够在植入的个体环境中增殖、分化，为具有完全生理结构和正常功能的肌腱组织[6]。

生长因子是通过与高亲和的特异细胞膜受体结合，调控细胞生长周期的多肽类物质。其作用时几乎都存在时间、剂量依赖和生物活性衰退等问题，通过基因转染技术将生长因子转染到组织或细胞，能增强表达特定蛋白，达到缓慢持续释放的效果[7]。常见肌腱愈合的生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、骨形成蛋白和成纤维细胞生长因子等，被广泛用于肌腱损伤的基因治疗[8-9]。目前，应用干细胞和基因技术治疗多种疾病，但专题报道促进闭合性不完全肌腱损伤修复的文献较少。本文综合近年临床和实验研究，为干细胞和基因技术促进闭合性不完全肌腱损伤修复做一综述。

1 肌腱损伤概述

1.1 肌腱的解剖结构及损伤后愈合过程

肌腱由分布散乱的梭形腱和纵行排列的胶原纤维构成。胶原纤维呈螺旋形、线形和交叉走形，由纤维细胞基质分隔成束，其腱鞘被覆于浅层，同时融合了肌腱腱系膜和血管系膜，在腱系膜中有动脉[10]。肌腱来自血管的营养较少，自身的修复愈合能力十分有限，仅通过瘢痕形成来愈合，愈合后容易出现瘢痕及钙化等并发症[11]。肌腱愈合大体概括为3 个阶段：炎性反应期、增殖修复期和重塑期，这3 个阶段互有重叠。在第一阶段，中性粒细胞等炎症细胞伴随红细胞移动到受损处，伤后最初1 d 内巨噬细胞和单核细胞也同样被动员，到损伤局部吞噬坏死组织。释放一系列如化学趋化因子等激活血管生成和腱细胞增殖。炎症通常只持续1 周左右，随即是增殖修复期，此过程持续1 个月左右。损伤局部的腱细胞参与合成大量蛋白聚糖和胶原，黏多糖和水分聚集较多后开始肌腱的重塑，此过程可分为强化期和成熟期[12]。

1.2 运动员肌腱损伤特点

从外观来看，肌腱损伤分闭合性损伤和开放性损伤；从组织连续性来看，分完全断裂和不完全断裂损伤；还有夹杂在一起的混合性损伤。不同类型，治疗方法不同[13]。专业运动员多因其专项动作的反复练习形成肌腱劳损和部分断裂损伤，如田径运动员以快速跑、跳类训练居多，爆发性运动导致髌腱重复应力增加，损伤概率大。维多利亚体育评估研究所对近几年的髌骨肌腱病调查发现，除了病理因素外，因运动相关工作造成肌腱病占69%[14]；速度、对抗型运动员要求快速的移动能力和强劲的爆发力，肌腱负荷的强度、方向和时间快速改变，肌腱损伤的概率会大大增加，如羽毛球运动员跟腱部分断裂伤[15]。业余健身爱好者大多集中在周末或节假日锻炼，因缺乏平时训练和对运动强度不敏感，极易出现肌腱牵拉伤，Xu 等[16]在兔模型上证实了这个现象。

1.3 肌腱损伤治疗现状

闭合性不完全肌腱损伤临床上常出现疼痛、渗出、红肿和功能障碍等症状，在病理学上最直接的表现就是肌腱炎和腱鞘炎[17]。目前，国内外临床治疗肌腱损伤的方法有口服非甾体类消炎止痛药、应用传统医学的中药熏洗和针灸理疗、现代声光电康复治疗等[18]。运动过程中急性肌腱损伤大多需要制动，石膏或者绷带固定只能阻止肌腱二次损伤，并不能使肌腱自然愈合，如果恢复不好常常有挛缩或异位钙化等后遗症。慢性劳损和肌腱病常采取休息、口服非甾体类消炎药和物理治疗，同样只能缓解部分症状，不能促进肌腱的自然愈合[19]，其反复疼痛严重影响运动员的训练和比赛成绩，中国飞人刘翔就是因肌腱病最终影响了他的成绩和运动寿命。鉴于此，一是专业运动员及广大运动爱好者要高度重视此病；二是急需找到肌腱损伤更好的新型疗法。

2 干细胞促进肌腱愈合的研究进展

2.1 骨髓间充质干细胞

BMSCs 是从骨髓中分离得到的非造血基质干细胞，具有多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、肌腱细胞等。BMSCs 容易分离和体外培养，几乎无免疫原性，易于外源基因转染和表达[4]。外源目的基因通过病毒载体整合至BMSCs 基因组中更容易自我更新并分化为特定肌腱组织细胞[7]。因取材简便、来源广泛等优点，BMSCs 已成为组织工程领域中多种组织再生重要的种子细胞来源[20]。近年来，干细胞治疗成为临床和科研的一个新热点。BMSCs 已成熟应用在骨和软骨的修复，临床试验中也可发现这种新的治疗方法，但是用于肌腱的修复及再生，BMSCs 的研究才走出第一步。Wang 等[21]研究揭示，VEGF 转染64 只鸡的128 个指伸肌腱，组织转染效率达到100%，并在转染后2、4、6、8 周检测肌腱愈合相关指标，结果证实转染的基因可在损伤部位维持较长时间表达，并且可以显著提高肌腱愈合，不会加重肌腱愈合后的黏连。该研究证实BMSCs 可作为修复闭合性不完全肌腱损伤的种子细胞。BMSCs 具有克隆形成、自我增殖和多向分化的能力，在特定条件下可向肌腱、骨、软骨、脂肪等分化[4]。因具有这些特性，BMSCs 被广泛应用于基础研究和临床治疗[22]。近年来，BMSCs 的应用被引入运动医学领域，用于修复运动过程中产生的急性或慢性不完全肌腱损伤。Bi 等[23]用手术方法造成大鼠髌腱不完全断裂模型，然后将BMSCs 和VEGF 转染后的BMSCs 分别注入髌腱缺损处，同时以普通生物材料修补和完全空白为对照组。术后第4、8、12 周取材进行检测，比较各组之间肌腱修复标志物的表达。经组织形态学和生物力学综合分析，VEGF 转染后BMSCs 可缩短愈合时间、促进肌腱愈合，同时对肌腱的生物学特性也有改善作用，且效果明显优于普通生物材料修补和单纯的BMSCs 组。Liu 等[24]用新西兰大白兔建立跟腱损伤模型，设置BMSCs 组、自体肌腱移植组和空白对照组，8 周后取材观察肌腱愈合情况。结果显示，新西兰大白兔BMSCs 组可促进跟腱损伤愈合，其疗效优于其他两组。上述可知，BMSCs 应用于医学领域组织的修复已有一定基础，为后续研究奠定了基石。

2.2 肌腱干细胞

TDSCs 又叫肌腱祖细胞，2007 年Zhang 等[25]成功从人腘绳肌和小鼠髌腱提取出来。TDSCs 不仅具有自我更新、克隆形成以及多向分化的潜能，还具有干细胞特性，其与肌腱细胞相关基因和蛋白表达较高[26]。随后研究者从人、大鼠、小鼠、马等不同部位肌腱中也成功地将TDSCs 分离出来，用于进行肌腱修复和肌腱生理病理的研究[27]。Tian 等[28]研究提示，植入自体TDSCS 修复有窗口样缺损的大鼠髌腱损伤进行观察，1 个月后胶原蛋白表达水平升高，纤维束和肌腱细胞有更加规则有序的排列。接受TDSCS 治疗者肌腱生物力学性能显著高于未接受TDSCS 治疗者。结论显示，在肌腱损伤修复过程中TDSCS 起关键作用。相对于BMSCs 而言，TDSCs 具备更好的增殖潜能，能够形成较多细胞集落，还能表达更多的肌腱标志相关基因，如scleraxix、tenomodulin 等；此外，TDSCs 还可以有更多肌腱细胞的胞外基质产生，如核心蛋白聚糖，Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等。因此，TDSCs 可作为理想的细胞来修复肌腱损伤[29]，但调控TDSCs 的因素非常多，常见因素有氧分压、细胞外基质、机械负荷和生物因素等，作用机制复杂、特性尚不完全清楚[30]，其在研究和临床中的应用仍受到很大限制，需进一步研究。

2.3 胚胎干细胞

ESCs 是来源于胚胎的多能干细胞，具有分化为不同类型细胞和无限增殖的潜能。研究[31]提示，人和部分动物皮肤破损之后，能够无瘢痕、功能性愈合，但是成体组织不行，这说明ESCs 可能存在某些“再生记忆功能”，能够在植入的个体环境中增殖、诱导分化为具有完全生理结构和功能的正常组织。研究[32]发现ESCs 修复肌腱损伤的可行性并探讨其相应机制，通过肌腱特殊基因和结构表达证实了肌腱组织模型中ESCs 再生的肌腱组织。Tang 等[33]用ESCs 修复肌腱比对照组有更好的结构和力学特性，而且其活性可以在肌腱损伤处保持更长时间。此外，ESCs 可以通过分泌一些肌腱特殊基质和分化因子，使肌腱内源性再生程序被进一步唤醒。前述可知，ESCs 具有某些特殊“记忆功能”，对具有完全生理结构和正常功能的肌腱组织有再生能力。在肌腱损伤处分泌的人胚胎特异基质和分化因子促进了肌腱再生，为肌腱修复提供了新方案和理论基础。

2.4 BMSCs、TDSCs、ESCs 三者间比较

BMSCs、TDSCs、ESCs 在不同的条件下都能向肌腱分化，但具有各自的特点。BMSCs 是肌腱组织工程中应用广泛的种子细胞，从目前报道来看其完全再生肌腱还不成熟，且有一定程度的异位骨化，基因转染浓度和时间等都还需进一步探索[34]；TDSCs 被鉴定为一个独特的干细胞群体后广泛用于肌腱修复，但其来源有限，一定程度上限制了其发展[26]；ESCs 再生记忆功能能实现向受损组织完全复制，只是从胎儿提取用以科研和临床不现实，大多用ESCs 来源的MSCs 构建出肌腱组织[31]。

3 生长因子促进损伤肌腱修复的研究进展

3.1 血管内皮生长因子

VEGF 是一种内皮细胞的有丝分裂原，通过激活一氧化氮合酶增加毛细血管的通透性，促进血管生成[34]。人体组织损伤修复主要依靠神经和血管参与，肌腱修复过程中最关键的是产生和维持有功能的微血管网络，为肌腱生长、分化和功能化提供氧气和营养物质[9,35]。VEGF 可以激活内皮细胞，刺激使其以因子在受损部位以浓度梯度募集，促进细胞整合，血管形成和成熟[36]，上调的成血管生长因子包括VEGF、FGF 和肝细胞生长因子，其都对间充质干细胞向肌腱分化起到促进作用。研究[37]提示，BMSCs 向肌腱细胞分化过程中，VEGF 通过促进相关基因表达，调节细胞周期和改善微环境，使腱细胞凋亡和腱细胞生成达到一个动态平衡，进而修复受损的肌腱组织[38]。

3.2 转化生长因子

转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）是一类多功能蛋白多肽，有调节细胞分化、调控细胞增殖、促进基质合成的功能，在肌腱愈合过程中较为活跃，对肌腱黏连修复影响较大[39]。Tuzmen 等[40]在兔模型中对TGF-β mRNA 的激活进行了研究，TGF-β存在于正常肌腱和腱鞘细胞，它可在肌腱损伤时被活化，mRNA 上调明显。同时肌腱细胞、腱鞘细胞和炎性细胞中表达均上调，对肌腱的修复提供了一个双重机制，该实验显示，TGF-β 在一定程度上限制损伤肌腱的黏连，阻止肌腱畸形愈合。TGF-β 转染MSCs 成肌腱特性较强，从而达到修复肌腱的目的。

3.3 骨形成蛋白

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具备成骨诱导活性已广为人知，研究[41]提示，其在成肌腱分化对肌腱损伤愈合中亦有不可忽视的作用。有报道[12]BMP-12 具有诱导BMSCs 成肌腱分化的潜能，还可促进肌腱细胞增殖与分化，使组织工程化肌腱的体外构建打下基础。通过BMP-12 与大鼠BMSCs 共培养，检测发现SCX 和Tnmd 呈阳性表达，并且随着时间推移其表达量逐渐增多，在14 d 时趋于稳定。该实验显示BMP-12 可能在早期诱导肌腱再生中起主导作用。BMP-14 基因治疗可显著促进鼠跟腱撕裂伤模型的愈合，基因转染后经生物力学测试肌腱拉伸强度显著高于对照组[42]。

3.4 其他生长因子

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）已被证实具有促进肌腱组织愈合的作用，并已被用于基因治疗。FGF 是一类可通过与细胞膜上特异受体相结合而发挥多种生物学作用的多肽分子，它对细胞的增殖、新血管形成和细胞有丝分裂都有促进作用，现已广泛应用于各种组织修复的研究。研究[43]提示，FGF 可促进分化中肌腱细胞发生迁移和集落形成，促进软骨细胞和腱细胞增殖和成熟，可应用于跟腱修复，促进机体愈合。胰岛素样生长因子（insulinlike growth factors，IGF-1）通过刺激细胞分化、调节细胞凋亡和诱导肌腱标志物的表达可调节MSCs 的成肌腱分化。部分学者认为IGF-1 和TGF-β 在成肌腱分化的过程是相互独立而效应是相互叠加的[44]。此外，血小板源性生长因子、低氧诱导因子、甲状旁腺素等在成肌腱分化过程中也起着重要作用[45]。运动医学领域对这些生长因子的研究进展一直呈持续关注状态。

4 展望

以干细胞为基础的基因治疗促进肌腱损伤修复近年来被提到一个新的高度，这种治疗方式打破了传统的医药康复观念，随着研究的深入和完善，有望建立一种全新的治疗方法，给广大肌腱损伤的患者带来福音[46]。然而，干细胞的应用目前主要停留在动物实验上，应用于患者还需进一步的研究。首先，腺病毒和生长因子虽然能够增强干细胞向肌腱组织的转化，但其时间、浓度依赖性和突变、肿瘤等问题还没完全解决，无法进行人体实验；其次，应用条件、技术和伦理等问题还有待探索[47]。植入的干细胞在停泊、生长、转化、与受体组织的融合、功能发挥、神经体液调节等方面的基础研究还需要继续[48]。综上所述，干细胞为基础的基因治疗有许多其他药物无法比拟的优点，但也存在不少未解决的问题，使用于临床，还需进一步的研究和探索。