PI3K 及p-Smad7 的表达对骨肉瘤细胞增殖的影响

张小平 于 哲 胥 云 闫 康 廖 博 周 勇 高铜拴

解放军空军军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所，陕西西安 710032

骨肉瘤是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤，多见于儿童和青少年，好发于血运丰富的长骨干骺端，具有恶性程度高、转移发生早、病情进展迅速且病死率高等特点，临床治疗的失败率和死亡率较高[1]。骨肉瘤是极为难治的骨科肿瘤，其高转移和侵袭性导致炎症浸润和淋巴结转移。骨肉瘤的发生、发展是个复杂的过程，其中炎性因子的浸润、成纤维细胞的激活、MAKP 信号通路的活化等，都促进其增殖和转移能力[2]。研究表明，PI3K/p-Smad7 信号通路在胃癌、结肠癌和肝癌等肿瘤组织中，可以促进肿瘤细胞增殖和侵袭作用[3-4]。PI3K/p-Smad7 可以激活肿瘤上皮细胞间质转型的发生，同时促进肿瘤干细胞的激活和转化，有文献分别报道了PI3K 在骨肉瘤中的促癌作用和p-Smad7 对骨肉瘤的高转移和侵袭性影响[5]。但是PI3K 和p-Smad7 联合形成的分子信号通路间的相互作用和相关性，以及两者对骨肉瘤增殖作用影响尚不完全明确。因此，本研究采用骨肉瘤患者癌组织和骨肉瘤细胞系MG-63，探讨PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表达及其作用。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2017 年1 月～2018 年10 月解放军空军军医大学唐都医院（以下简称“我院”）骨科收治的60 例骨肉瘤患者（骨肉瘤组织）和同期60 例软骨组织（正常组织）为研究对象。纳入标准：首次就诊，且经我院病理检验科诊断证实，均未经任何治疗。排除标准：①患有严重传染性疾病和血液传染病；②依从性差，无法配合研究者；③合并严重感染、心脑血管疾病以及肝肾功能严重障碍者；④合并其他骨病或系统性疾病。本研究方法和目的均告知患者和家属，并签署知情同意书，研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 材料

骨肉瘤细胞系MG-63 购自中国科学院上海细胞库；蛋白定量试剂盒（P503021-0500）、SDS 凝胶试剂盒（P0012A）、细胞裂解液（P0013）、结晶紫（P8470-25g）均购自上海吉玛生物有限公司；DMEM（SH30021）、胎牛血清（SH30406）、胰蛋白酶消化液（SV30042）购自美国HyClone；青链霉素混合液（P1400）、4%多聚甲醛（P1110）、苯胺蓝（28631-66-5）和苏木精（C0107）均购自武汉依科有限公司；Actin（ab179467）、PI3K（ab32089）、p-Smad7（ab114358）和兔二抗（ab150077）购自英国Abcam。PrimeScriptTMRT 试剂盒（R0047A）和SYBR（RR1297）购自中国TaKaRa。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化染色 石蜡切块进行脱蜡和水化处理，抗原修复后滴加封闭液；1∶500 稀释HGF 一抗孵育；孵育结束后用PBS 进行冲洗，加生物素标记的二抗进行孵育；PBS 再次冲洗，滴加链霉亲和素-过氧化酶溶液孵育。次日DAB 显色液显色，苏木精染液复染，中性树脂胶固封；PBS 作为一抗阴性对照组，阳性细胞着色为棕黄色。

1.3.2 MTT 增殖实验 调整MG-63 细胞数4×105个/孔，对照组细胞直接铺板，实验组PI3K 抑制剂CAL-101（2.5 nm）处理骨肉瘤MG-63，37℃，5%CO2培养箱内培养24、48、72 h。培养结束后每孔加入20 μL 的MTT，37℃，5% CO2培养箱内培养避光孵育4 h，室温于摇床震荡10 min。酶标仪490 nm 波长测出同一时间点OD 值，用OD 值进行细胞增殖影响的分析。

1.3.3 克隆形成实验 将对数生长期MG-63 细胞消化，调整密度为300 个/孔，对照组细胞直接铺板，实验组PI3K 抑制剂CAL-101（2.5 nm）处理骨肉瘤MG-63，培养48 h 接种至6 孔板，每孔加2 mL 的10%胎牛血清DMEM 培养液。细胞接种5 d 后每孔各加500 μL 胎牛血清继续培养。贴壁生长15 d 后，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%结晶紫溶液染色15 min，PBS 轻轻冲洗细胞，室温风干后计数多于50 个细胞的克隆。

1.3.4 qRT-PCR MG-63 细胞数4×105个/孔，对照组细胞直接铺板，实验组PI3K 抑制剂CAL-101（2.5 nm）处理骨肉瘤MG-63，培养箱设定37℃、5%CO2培养细胞，36 h 后收集细胞，向细胞中加入1 mL Trizol试剂以提取总RNA，严格按照PrimeScriptTMRT 试剂盒的说明将RNA 逆转录成cDNA，随后加引物和SYBR Green。PCR 反应条件：在95℃下进行40 个循环5 s，在95℃下变性10 s，在60℃下退火20 s，在72℃下延伸15 s。每个样本提供3 个重复的孔。使用Actin 作为参考标准，使用2-ΔΔCt计算mRNA 的相对表达水平。引物序列如下，Actin：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；PI3K：5′-ATCCTTTCCCGCGACACCCGAT-3′，5′-TCCCAGGCGTAGACCAA-3′；p-Smad7：5′-AGCCAATT-TTAACTGAGGAGT-3′，5′-GGCAAGTTGATTGGAGG-GA-3′。

1.3.5 Western blot 调整MG-63 细胞数4×105个/孔，对照组细胞直接铺板，实验组PI3K 抑制剂CAL-101（2.5 nm）处理骨肉瘤MG-63，培养箱设定37℃、5%CO2培养细胞，36 h 后收集细胞，PBS 洗涤1 min后加含有蛋白酶抑制剂的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速离心（13 000 r/min，离心半径30 cm）吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min。SDS-PACE 电泳后进行转膜操作，转膜成功后用脱脂牛奶进行封闭，PBST 清洗，均为1∶1000 稀释Actin、PI3K 及p-Smad7，室温孵育1 h 后4℃过夜。次日反复清洗条带，加兔二抗室温孵育90 min，PBS 反复冲洗，发光拍照。

1.4 统计学方法

所有数据应用SPSS 16.0 软件进计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色检测PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤组织和正常组织中的表达

骨肉瘤组织中PI3K 及p-Smad7 的表达显著高于正常组织，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图1（封三）。

图1 免疫组化染色检测PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤组织和正常组织中的表达（见内文第9 页）

2.2 PI3K 抑制剂CAL-101 对MG-63 细胞增殖能力的影响

给药处理48、72 h 后，实验组的MG-63 细胞增殖能力明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 PI3K 抑制剂CAL-101 对MG-63 细胞增殖能力的影响

2.3 PI3K 抑制剂CAL-101 对MG-63 细胞克隆形成能力的影响

给药处理48 h，继续培养15 d 后，实验组的MG-63细胞克隆形成能力明显低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

2.4 PI3K 抑 制 剂CAL-101 对MG-63 细 胞PI3K 及p-Smad7 表达的影响

给药处理36 h 后，实验组的MG-63 细胞PI3K及p-Smad7 表达均明显低于对照组，且p-Smad7 随着PI3K 被抑制而显著降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

3 讨论

骨肉瘤是骨科最常见的肿瘤之一，由于恶性骨肿瘤治疗效果差，5 年存活率仅为20%[6]。骨肉瘤具有侵袭性强、易复发、治疗效果差等特性，导致其治疗难度增加。近些年研究发现，PI3K/p-Smad7 信号通路与骨肉瘤的发生、发展、转移和侵袭密切相关，因此其备受国内外学者的关注[7-8]。

图3 PI3K 抑制剂CAL-101 对MG-63 细胞克隆形成能力的影响

PI3K 是PI3K/p-Smad7 信号传导通路中的主要调节蛋白，PI3K 已经被证实为一种促癌基因，是通过原位杂交技术在宫颈癌细胞中发现的，其具有类脂激酶和蛋白激酶的双重生物活性，可以活化AKT，从而参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和转移等一系列生物学行为[9-10]。p-Smad7 是TGF-β 信号通路的负调控蛋白，在肝癌中p-Smad7 可以促进肝肿瘤细胞的增殖和转移[11]。最近的几项研究表明，p-Smad7/PI3K 信号通路在肿瘤发生、发展过程中起重要作用[12-13]。有研究发现，PI3K 在结直肠癌中的表达增高，同时p-Smad7表达也在增高，其可以激活下游分子Twist 结合导致癌细胞迁移和侵袭能力显著增加[14-15]。有研究证明，p-Smad7/PI3K 信号通路通过上调N-cadherin 诱导连环蛋白基因和抑制E-cadherin 从细胞质转移至细胞膜来促进胃癌细胞的侵袭[16]。p-Smad7/PI3K 信号通路通过促进N-cadherin 翻译间接上调其下游效应基质金属蛋白酶9，从而促进肝癌转移[17-19]。研究表明，p-Smad7/PI3K 信号通路在肿瘤迁移和侵袭以及上皮细胞间质转型发生、发展过程中起重要作用[20-21]。但p-Smad7/PI3K 信号通路对骨肉瘤的影响及对骨肉瘤细胞增殖能力影响如何尚不完全明确。

图4 PI3K 抑制剂CAL-101 对MG-63 细胞PI3K 及p-Smad7 表达的影响

本研究结果显示，PI3K 及p-Smad7 表达在骨肉瘤患者癌组织中的表达高于正常组织，提示骨肉瘤的发生发展与PI3K/p-Smad7 信号通路表达有密切的关系。体外细胞实验表明，PI3K 抑制剂CAL-101 能够抑制骨肉瘤MG-63 细胞的增殖能力，与肿瘤组织中PI3K 及p-Smad7 表达检测结果一致，说明PI3K/p-Smad7 信号通路激活促进了骨肉瘤的增殖能力。此外，PI3K 抑制剂CAL-101 给药处理后MG-63 细胞PI3K 及p-Smad7 表达变化均显著降低，提示PI3K/p-Smad7 激活可以增强骨肉瘤的增殖、转移和形成远端病灶。

综上所述，PI3K 及p-Smad7 在骨肉瘤中的表达异常增高，从而促进骨肉瘤形成转移病灶。而PI3K/p-Smad7 信号通路上游如何，其如何来调控PI3K/p-Smad7 信号通路，均有待于进一步研究证实。