桑叶中1-脱氧野尻霉素提取纯化及检测方法研究进展

石万银，徐 剑，杨跃军，刘源才，巫 岳，向诗银，唐 万

（劲牌生物医药有限公司，中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北黄石 435100）

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶[1]，其化学成分含量丰富，主要含有黄酮、多糖、脂类、生物碱、挥发油、植物甾醇等成分[2]。现代研究表明，桑叶中生物碱类成分主要包括野尻霉素及其衍生物，如1-脱氧野尻霉素（DNJ）、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、2-氧-α-D-半乳吡啶糖苷-1-脱氧野尻霉素、1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇、荞麦碱、3-表荞麦碱等[3]。其中，DNJ属于强效α-葡萄糖苷酶抑制剂[4]，能降低二糖的消化和葡萄糖的吸收来降低餐后血糖。Yoskihuni Y[5]研究了大鼠服用DNJ后血糖的变化，结果表明，大鼠使用淀粉、蔗糖等碳水化合物时DNJ能抑制血糖上升，降低血糖峰值。施新琴等人[6]测定了7个家蚕品种或杂交组合、用5个桑品种和不同叶质桑叶饲养5龄蚕制备的全蚕粉中1-DNJ含量，同时测定了由相应的全蚕粉配制的蚕粉复合物对小鼠灌胃后1.5 h血糖值的影响。结果表明，不同家蚕品种、用不同桑品种和不同叶质桑叶饲养家蚕制备的全蚕粉复合物的降血糖效果均存在显著差异，凡是降血糖效果显著的全蚕粉，1-DNJ含量都处于较高水平。胡竟一等人[7]研究了桑叶的α-葡萄糖苷酶抑制作用，结果表明，终质量浓度25，50，100，200 mg生药/mL的桑叶煎剂和桑叶生物碱均具有显著的α-糖苷酶抑制作用，终质量浓度100，200，400 mg生药/mL的桑叶多糖抑制α-糖苷酶的作用不明显，终质量浓度50，100，200 mg生药/mL的桑叶黄酮抑制α-糖苷酶的作用弱，说明桑叶生物碱是桑叶α-糖苷酶抑制作用的主要有效部位。

桑叶价廉易得，其DNJ降血糖活性好、安全性高，近年来DNJ逐渐被用于药品和保健食品中，其分离纯化和检测、技术研究也逐渐深入，但存在DNJ在桑叶药材中含量较低、分离纯化工艺复杂，且DNJ本身无紫外吸收，常规检测方法不适用等问题。通过查阅国内外文献，对DNJ分离纯化技术和检测方法研究进行全面概述，以期为桑叶DNJ的分离纯化及检测提供参考。

1 DNJ的提取研究概况

1.1 水提取法

水作为DNJ提取最常用的溶剂，成本低、安全性高、方便易得，文献报道中除用纯水提取外常见的还有水中加入酸调节pH值、加入纤维素酶进行DNJ提取。

1.1.1 水提取

胡瑞君等人[8]以无菌过滤水为溶剂，利用微波辅助提取技术，考查了微波功率、提取时间、料液比和提取次数对桑叶DNJ得率的影响，确定了最佳提取条件为微波功率406 W，提取时间1.5 min，料液比 （药材∶溶剂） 为1∶40（g∶mL），提取次数2次。刘树兴等人[9]以水为溶剂，通过单因素试验筛选对提取有显著影响的因素，并通过正交试验确定1-脱氧野尻霉素（DNJ）和多糖提取最佳的方案，DNJ的最佳提取方案为料液比 1∶30，物料粒径60目，提取温度70℃，提取时间3 h。

1.1.2 酸水提取

魏晓蕊[10]比较了酸水和超声波辅助提取对桑叶DNJ提取效果，其中酸水法提取条件为溶剂pH值2的水溶液，料液比25∶1，在70℃条件下提取2.5 h，DNJ提取率为0.166%，超声波辅助提取条件为以水为溶剂，料液比1∶16，提取温度75℃，微波功率350 W，提取时间 60 min（超声 3 s，间隔 5 s），DNJ提取率为0.187%。

1.1.3 纤维素酶提取法

赵翔[11]通过对纤维素酶质量浓度、提取时间、提取温度、料液比进行筛选，并采用响应面法进行酶法提取桑叶DNJ的工艺条件，确定桑叶DNJ的最佳提取条件为纤维素酶质量浓度3.4 mg/mL，料液pH值3.8，料液质量浓度0.017 0 g/mL，在60℃条件下提取1.0 h，桑叶DNJ的提取率为0.0950%。

1.2 乙醇提取法

乙醇作为常用的有机溶剂，安全性好且可以回收利用，常用作桑叶DNJ的提取。

1.2.1 乙醇提取

唐满生等人[12]对桑皮的提取温度、提取时间及乙醇体积分数进行考查，确定桑皮中DNJ最佳提取条件为乙醇体积分数60%，在60℃下提取2 h，得到提取物中DNJ的含量为3%左右。李宇亮等人[13]通过对桑叶提取方法考查，确定桑叶DNJ提取方法为以体积分数65%的乙醇为提取剂，按料液比1∶8超声强化细胞破碎20 min（功率1 800 W）。

1.2.2 酸性乙醇提取

薛婷婷等人[14]采用乙醇从新鲜桑叶中提取DNJ，得到最佳提取条件为乙醇体积分数65%，pH值3.5，料液比1∶11，提取温度55℃。马静[15]采用正交试验筛选出桑叶DNJ最佳提取条件为物料粒60目，乙醇体积分数75%，pH值1，料液比1∶30，提取温度55℃，DNJ得率为0.064%，含量为20.3%。关山[16]通过对料液比、乙醇体积分数和提取时间进行考查，确定桑叶DNJ最佳提取工艺为乙醇体积分数75%，料液比1∶8，回流提取1 h。

2 DNJ的分离纯化研究概况

2.1 树脂分离纯化

罗蕾蕾等人[17]采用AB-8型大孔树脂对桑叶提取液进行除杂处理，然后将上样液调节为pH值4后上732阳离子型树脂，上样速度为每小时1倍柱体积，用浓度为0.5 mol/L氨水进行洗脱，收集pH值9～10的洗脱液浓缩干燥，得到桑叶提取物DNJ含量为16.7%。杨翠平[18]采用D72型阳离子交换树脂、D296型阴离子交换树脂和氧化铝对桑叶DNJ进行纯化，其中D72型阳离子交换树脂纯化后，DNJ含量达到23.87%，是粗提液的15.12倍，样品溶液利用D296型阴离子交换树脂进一步纯化后，DNJ含量达到57.63%，比纯化前提高了2.41倍，纯化后的样品经过中性氧化铝柱层析后，DNJ纯度达到了63.92%，比纯化前提高了1.12倍。孟夏[19]采用国产001*7型阳离子交换树脂进行桑叶DNJ纯化，进行静态吸附试验、动态吸附试验，确定树脂对DNJ饱和吸附量为13.8 mg/g，上柱流速为1.5 mL/min，洗脱液氨水浓度为0.5 mol/L，纯化后得到DNJ含量为39.17%。

2.2 色谱柱分离纯化

周惠燕等人[20]采用反向色谱柱进行桑叶DNJ纯化，桑叶加入酸水超声提取、离心、浓缩干燥的固体加水溶解后过MCIgelCHP20P柱色谱，以不同浓度甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，收集含DNJ洗脱液浓缩，浓缩液过Sephadex LH-20型色谱柱，以甲醇-水为流动相梯度洗，收集洗脱液浓缩干燥，得到桑叶提取物DNJ含量为10.7%。

2.3 有机溶剂萃取

DNJ为极性化合物，有机溶剂萃取是采用相似相容的原理进行，一般选择极性较大的有机溶剂进行萃取。杨茹等人发明了一项从天然产物，包括桑叶、桑枝、桑白皮、桑椹、蚕沙，提取分离纯度高于98%的DNJ的方法，树脂纯化后的浓缩液加入酸调节pH值6.5～7.5，以氯仿萃取，保留水相；水相以正丁醇萃取，保留正丁醇相，浓缩至小体积，收集析出的固相再加入无水乙醇重结晶；结晶后的产品溶于少量纯水，通过凝胶柱层析，以标准品对照，收集薄层色谱Rf值和斑点颜色均一致部分，浓缩至干，得成品。其中，目标产物1-脱氧野尻霉素含量不少于98%。李宇亮等人[13]将桑叶药材用体积分数65%乙醇超声提取后过阳离子交换树脂，氨水洗脱液浓缩后用正丁醇萃取，萃取液浓缩干燥后DNJ含量可达93.2%。

3 检测方法研究概况

3.1 高效液相色谱法

DNJ通过高效液相色谱法进行含量检测时，一般先采用合适的衍生剂进行衍生，生成具有紫外吸收的衍生络合物后再进行检测，或者是采用蒸发光散射检测器进行检测。杨翠平等人[18]采用FOMC-Cl为衍生剂对DNJ进行衍生，并在衍生后加入适量甘氨酸溶液以消除多余的衍生剂，采用inertsil HPLCNH2型色谱柱，以乙腈-水（75∶25）为流动相，于波长256 nm处检测DNJ，并进行方法学考查。结果表明，该方法稳定可靠，可用于检测桑叶中DNJ含量。蒋磊等人以FOMC-Cl为衍生剂对DNJ进行衍生，以乙腈-0.1%醋酸（55∶45）为流动相，波长254 nm处检测DNJ。结果表明，该操作方便、检测结果准确，可以作为常用的DNJ检测方法。梁建宁等人采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定桑白皮中1-脱氧野尻霉素的含量，色谱柱为Hypersil NH2柱，流动相：乙腈-水（78∶22），蒸发光散射检测器漂移管温度50℃，载气流速2×105Pa。

3.2 高效液相色谱-串联四极杆质谱法

戴开金等人采用高效液相色谱-串联四极杆质谱法测定桑叶中1-脱氧野尻霉，以乙腈-0.1%甲酸水溶液（12∶88，V/V）为流动相，SHIMADZUHRCNH2型柱分离，采用大气压化学电离源（APCI），164.1/146.1，164.1/110.2两对离子，多反应监测（MRM）。结果表明，1-脱氧野尻霉素保留时间为2.87 min，标准曲线在质量浓度482～2 410 μg/L范围内线性关系良好（R2=0.999 3），平均加样回收率为95.8%，最低检测限为53.6 μg/L。

3.3 气相色谱法

李宏等人利用化学合成法将DNJ转化成沸点较低的酯类物质，建立了用气相法快速检测DNJ的新方法，检测到桑叶中DNJ含量达到0.129 4%。汪孟夏等人采用毛细管柱气相色谱法测定桑叶中DNJ含量，考查了不同溶剂和不同提取方式对桑叶中DNJ提取的影响，最终确定用吡啶作为提取试剂在超声波条件下处理时间30 min为毛细管气相色谱法测定DNJ的最佳提取条件。用醋酸苷作为乙酰化试剂，盐酸羟胺作为催化剂，在水浴90℃条件下乙酰化30min。通过方法学考查确定色谱条件为色谱柱OV-1701型，初温285℃×5 min，以10℃/min上升至295℃，维持25 min，以20℃/min下降至285℃；汽化室温度310℃，检测口温度310℃，氢气流量47 mL/min，进样量1 μL，火焰离子检测器（FID），结果表明该方法准确可靠。

4 结语

（1） DNJ多采用水和乙醇进行提取，常见的方法有微波提取法、超声波辅助提取法和热提取法，纯水和乙醇只能将植物体内游离的DNJ类成分提取出来，加酸后DNJ可与酸结合成盐易于溶出，同时酸性条件可以使植物细胞壁发生软化，有利于DNJ提取；纤维素是植物细胞壁的主要成分，也是细胞内活性成分溶出的屏障，用纤维素酶处理桑叶药材，可以降解细胞壁中纤维素类成分，有利于细胞内成分的溶出；适宜体积分数的乙醇提取还能避免一些水溶性杂质（蛋白质、多糖等）干扰。

（2） DNJ分离纯化方法最常用的为树脂分离纯化，DNJ分子结构中含有氨基，在溶液中带正电荷，能与阳离子交换树脂上的H+或Na+发生交换，然后再用带正电荷的溶液（如氨水）将DNJ交换下来，操作方便，常用作大生产上DNJ的纯化。有机溶剂萃取也能提高桑叶DNJ含量，但毒性大、成本高，桑叶DNJ多作为保健食品原料，有机溶剂萃取存在食品安全风险，色谱柱分离纯化可得到纯度较高的化合物，但批量小，这2种方法在生产上应用较少。

（3） DNJ分子结构与糖类似，分子中无共轭基团，也无紫外吸收，且水溶性好、极性大，用紫外检测器、C18反向色谱柱检测困难，质谱法与气相色谱法检测方法复杂且仪器成本高，故目前多用氨基柱，柱前衍生法-高效液相色谱法或者蒸发光散射检测器-高效液相色谱法进行DNJ含量检测。