化疗所致造血干细胞衰老的相关信号通路及中药治疗进展

王珏，陈朝辉

(1.浙江中医药大学附属第三医院，浙江 杭州 310053；2.象山县第一人民医院，浙江 象山 315700)

随着发病率和死亡率的不断提高，癌症已成为我国主要的死亡原因，也是重大的公共卫生问题。发布的文献显示[1]，2015年我国新发肿瘤病例429.2万，致死病例281.4万。虽然癌前检查的技术不断得到提升，但是大多数肿瘤患者在疾病被诊断时已处于中晚期，化疗是肿瘤治疗手段中必不可少的，化疗的疗效确切，但在杀伤肿瘤细胞同时，往往也对正常的细胞造成损害，尤其是对骨髓造血功能的抑制，有研究表明[2]90%以上的化疗药物都会引起骨髓抑制。目前认为化疗导致骨髓抑制最关键的机制[3]是造血干细胞衰老。

造血干细胞衰老的机制目前仍不明确。现有研究[4]表明其机制包括DNA损伤、端粒缩短、活性氧(ROS)水平升高、表观遗传修饰、细胞极性改变、代谢及造血微环境等几方面，涉及到多条信号通路。多数研究[5-6]认为不同的DNA损伤因素最终均会通过p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路抑制正常细胞周期的进行，使细胞周期阻滞于G1期，最终导致细胞衰老。p53-p21通路也能间接的被端粒缩短所激活，进而引起造血干细胞衰老[7]。ROS水平升高可以直接或者间接的激活p38-MApK、p53-p21、p16-Rb通路导致造血系统应激能力下降而造成造血干细胞衰老[8]。

化疗后骨髓抑制属于中医“虚劳”范畴，其病机主要表现为脾肾两虚。多种中药复方及中药单体被证明，在防治骨髓抑制，抑制造血干细胞衰老上有着良好的作用及优势。现将造血干细胞衰老的相关信号通路，及中医药干预的研究做一综述。

1 造血干细胞衰老相关信号通路

1.1 p53-p21Waf1/Cip1通路

研究显示，化疗造成DNA损伤后，会招募和激活ATR和ATM两种蛋白激酶聚集于DNA损伤部位，ATR和ATM分别感应不同形式的 DNA 损伤，可以使损伤部位的H2A组蛋白变异体(H2AX)磷酸化进而触发DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)[9]以及周期检测点激酶CHK2和CHK1的磷酸化，再通过下游级联激活反应将DDR信号扩散，从而诱导p53的激活[10]，p53能够直接诱导周期蛋白依赖型激酶抑制剂p21的表达，从而下调CDK2，最终将细胞周期阻断在G1期，从而抑制细胞自我更新能力，造成造血干细胞衰老[11]。

1.2 p16 Ink4a-Rb通路

研究表明，当体内ROS水平升高到一定水平后能够激活p38/MApK通路[12]，进而激活另一周期蛋白依赖型激酶抑制剂p16Ink4a的表达，p16Ink4a作为CDK的主要抑制剂，可以抑制CDK4/6激活从而降低Rb的磷酸化而减少E2F基因的表达，导致细胞阻滞于G1期并且形成细胞衰老相关的异染色质位点[13]，使衰老进入不可逆阶段。

1.3 SIRT6 /NF-κB信号通路

SIRT6是调节细胞衰老的关键基因，乙酰化酶SIRT6的功能缺陷可影响DNA的修复，而导致衰老。有研究发现[14]，SIRT6能够促进NF-κB靶基因启动子H3K9的脱乙酰作用，从而抑制NF-κB信号通路调控的端粒非依赖性干细胞衰老。

1.4 Wnt/β-catenin信号通路

研究表明[15]Wnt/β-catenin信号通路可以调节造血微环境而引起造血干细胞衰老。当胞外不存在Wnt信号通路抑制物时，Wnt与细胞膜上Frizzled和LRp/56受体结合，抑制了GSK-3β活性，从而减弱其对β-catenin的磷酸化作用，引起β-catenin的聚集，进而向细胞核内移位，与FOXO转录因子结合，抑制β-catenin下游TCF/LEF的转录，引起造血干细胞衰老。

1.5 PI3K/AKT /mTOR信号通路

当外界信号激活磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphoinositide 3 kinases,PI3K)时，PI3K会将质膜上3、4-二磷酸磷脂酰肌醇(PI-4,5-P2, PIp2)磷酸化为3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PI-3,4,5-P3,PIp3)[16]，活化的PIp3会募集胞质内的丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)，通过与AKT N端的pH结构域结合协同激酶PDK1磷酸化AKT的丝氨酸磷酸化位点(Ser473)和苏氨酸磷酸化位点(Thr308)[17]，激活AKT，活化的AKT可以直接磷酸化mTOR使其激活，从而促进HSC的生长和存活等过程。

PI3K及其效应物AKT是维持HSC稳态的重要调节因子，部分PI3K的缺失会导致HSC再填充潜力的降低[18]。AKT和mTOR的过度激活会使HSC扩增，大量进入细胞周期，发生HSC的耗竭，这对于骨髓抑制的病人来说是一个恶性循环。研究发现,当同时敲除AKT1和AKT2时，会导致HSC滞留在G0期，无法向下分化。

1.6 Notch信号通路

Notch信号通路可以不通过第二信使，直接对下游HES、HEY，以及E47等核转录因子进行调节，对细胞的增殖分化具有重要影响作用。哺乳动物中存在Notch1-4四种Notch受体蛋白，以及Jagged-1,Jagged-2,Delta-like-1,3,4五种Notch配体蛋白，均为跨膜蛋白。Notch受体蛋白经三次酶切后跨膜进入细胞核，继而通过DNA结合蛋白CSL依赖或非依赖途径，促进转录因子HES和HEY、或抑制转录因子E47的功能，促进下游基因的表达，实现对细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和黏附等的影响[19]。

1.7 TGF-β信号通路

TGF-β被认为是HSC体外生长的最有效抑制剂之一。在稳态环境中，HSC处于休眠状态，而休眠状态对于维持HSC功能及数量起着非常重要的作用，TGF-β被发现是HSC休眠的主要调节因子。TGF-β信号通路的激活与Smad蛋白有着密切的关系。受体激活型R-Smads可直接被TGF-β磷酸化激活，然后与通用型Co-Smads结合，形成异源二聚体，进一步导致活性聚合体的核内累积，发挥针对靶基因的转录调控作用；而另有一种Smad蛋白—抑制型I-Smads，其发挥的作用刚好和受体激活型相反，I-Smads通过抑制TGF-β信号的传导，阻断R-Smads和Co-Smads的相互作用来负反馈调节TGF-β。Smad蛋白的磷酸化可以进一步上调细胞周期素依赖性激酶抑制剂如p15Ink4b、 p21Cip1和p27Kip1，从而干预造血干细胞的生长抑制[20]。

2 中药干预造血干细胞衰老

2.1 当归多糖对造血干细胞衰老的影响

中药当归有补血活血作用，被誉为“补血之圣药”“活血行气之要药”。《本草正》认为当归“诚血中之气药，亦血中之圣药也。”“凡有形虚损之病，无所不宜”。当归多糖是当归的主要成分，能够促进造血。张先平等[21-22]发现当归多糖能显著改善衰老造血干细胞G1期阻滞及SA-β-gal(β-半乳糖苷酶)阳性率的增加；增加端粒长度和端粒酶活性；下调p53、p21、p16的表达，上调CDK4/6、CyclinD及CyclinE的表达，进而减少细胞衰老。但研究发现当归多糖对CDK2的表达未见明显影响，因此当归多糖缓解造血干细胞衰老的机制可能与抑制p16-Rb信号通路过度激活有关。张岩岩等[23]发现，当归多糖能显著降低衰老造血干细胞的SA-β-gal 染色阳性率和ROS水平；通过下调β-catenin、phospho-GSK-3β和TCF-4蛋白表达，上调GSK-3β 蛋白表达，而这些蛋白都是Wnt/β-catenin 信号通路上的机制分子，故其研究认为当归多糖延缓造血干细胞的机制可能与抑制Wnt/β-catenin 信号通路过度激活有关。

2.2 党参多糖对造血干细胞衰老的影响

党参味甘，性平。有补中益气、止渴、健脾益肺，养血生津的作用。党参多糖是从党参中提取的有效成分，近年来的研究发现党参多糖在调节免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗应激、抗氧化等很多方面具有较好的生物活性。王慧云[24]发现党参多糖可以清除衰老血管内皮细胞内的自由基，降低细胞内的ROS水平；进一步的检测发现党参多糖可以影响衰老的EA.hy926细胞的甲基化程度及表观遗传相关蛋白及基因表达，使EZH2、Bmi-1、DNMT1 mRNA的表达含量升高，JMJD3 mRNA的表达量下降，减弱氧化作用下所导致的应激衰老进程，从而缓解血管内皮细胞的衰老。许朋等[25]发现党参多糖可以明显提升血清中C3、C4、IgG、IgM、IgA、GH、IGF-1、T3、T4、INS的生成水平，对环磷酰胺所致免疫功能低下大鼠具有明显的增强作用。进一步的研究显示，党参多糖不仅可以降低体内的ROS水平，改善氧化损伤，改善免疫功能低下，还能干预衰老相关的信号通路。李义波等[26]发现党参多糖干预后，β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率明显降低，造血干细胞G1期阻滞明显降低，并且p53、p21、Bax蛋白表达下调、Bcl-2蛋白表达上调。因此，实验证明党参多糖能够干预p53-p21信号通路从而延缓造血干细胞的衰老，同时也可以调控Bcl-2蛋白干预造血干细胞的凋亡。

2.3 人参皂苷对造血干细胞衰老的影响

人参自古誉为“百草之王”，味甘、微苦，性温、平。归脾、肺经、心经。补气，固脱，生津，安神，益智。人参皂苷被认为是人参中的主要活动成分，包括RH2、Rg1、Rg2、Rg3等，其主要作用表现为抗肿瘤、增强机体抗氧化及抗衰老能力、提升机体免疫能力等方面，临床上的研究多以人参皂苷Rg1为主要研究对象。周玥、李渊等[27-30]的多项研究发现，相较于衰老模型组，人参皂苷Rg1干预后，Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率明显下降，CFU-Mix数量明显升高；SIRT6 mRNA及蛋白表达上调，NF-κB mRNA及蛋白表达下调，证实了人参皂苷Rg1可能通过调控SIRT1/NF-κB信号轴抵抗造血干细胞的衰老。夏婕妤[31]发现人参皂苷Rg1干预后，Sca-1+HSC/HPCs增殖能力增强；形成CFU-Mix数量增加；SA-β-Gal染色阳性细胞百分率减少；细胞质及细胞核内β-catenin蛋白表达下调,GSK-3β蛋白表达量上降，TCF-4蛋白及β-catenin、C-myc、CyclinD1 mRNA表达下调；Sca-1+HSC/HPCs内ROS水平，γ-H2AX水平；血清中8-OH-dG含量下降；p53及p21蛋白及mRNA表达下调，说明人参皂苷Rg1可能通过p53/p21通路、细胞DNA氧化损伤、氧化应激等机制调控Wnt/β-catenin信号通路进而延缓Sca-1+HSC/HPCs衰老。Zeng YC等[32]的研究发现人参皂苷Rg1不仅能够改善衰老大鼠体内的氧化损伤，还能明显降低p16、p21、p53的表达水平，进一步降低其下游细胞周期蛋白CDK2和CDK4的表达，从p53-p21和p16-Rb通路缓解造血干细胞的衰老。

2.4 中药复方对造血干细胞衰老的影响

脾胃为气血生化之源，脾胃受损，脾失健运，则气血生化乏源; “肾藏精，精者，血之所成也。”肾精亏损，则血之源头穷竭[33]。故临床上治疗化疗后的造血干细胞衰老，多采用健脾补肾的方剂。张阳阳[34]发现补肾化瘀生新方可通过下调衰老关键基因p16INK4a、p53、p21的表达来延缓BMSCs的衰老，说明补肾化瘀生新方调控BMSCs的衰老与其抑制p16-pRb和p53-p21途径密切相关。相对于中药单体来说，中药复方成分更加复杂，其发挥作用的成分也更加多样，并且不同的配伍会导致中药效果存在差异。孔琳林等[35]发现，D-半乳糖可以诱导形成亚急性衰老大鼠，其体内的总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶(CAT)水平及抑制超氧阴离子自由基能力下降，过氧化氢(H2O2)含量升高，p16蛋白表达水平上调，左归丸对上述症状有逆转作用，说明p16通路可能是左归丸调控细胞衰老的机制之一。然而与左归丸相比，六味地黄丸未能明显降低大鼠体内H2O2含量，推测可能是因为左归丸中配伍的补阳药鹿角胶具有更加强力的抗氧化能力。

2.5 针灸对造血干细胞衰老的影响

针灸是中医针法和灸法的总称，是在中医理论指导下把针具(通常指毫针)按照一定的角度刺入患者体内，运用捻转与提插等针刺手法来对人体特定部位进行刺激从而达到治疗疾病的目的。针灸是中国特有的一种“内病外治”的治疗手段，针灸在临床上具有操作简便，疗效显著，成本低廉等优点。针对化疗后造成的骨髓抑制，研究发现[36]针灸环磷酰胺作用后的骨髓抑制小鼠，可以抑制Notch信号通路的过度激活，上调Notch信号通路相关差异基因numb1、numb2的表达，增强骨髓造血功能。因此，抑制Notch信号通路可能是针灸减轻CTX化疗引起的骨髓抑制、改善造血功能的分子机制之一。虽然有报道[37]称针灸可以改善阿尔茨海默病小鼠海马神经干细胞治疗后的脑微环境，然而，至今未见更多关于针灸干预造血干细胞衰老相关信号通路的研究。

3 小结

目前，针对化疗后造血干细胞衰老的信号通路研究，最集中最经典的还是p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路。中医药在延缓造血干细胞的作用中存在着多靶点的优势，如人参皂苷Rg1和当归多糖都能通过p53-p21Waf1/Cip1通路和p16Ink4a-Rb通路来调节造血干细胞的衰老，中药通过另外的通路缓解细胞衰老的研究也有建树。本课题组也在进行基于p16Ink4a-Rb信号通路探讨龟鹿二仙胶抗化疗诱导的骨髓造血干细胞衰老的分子机制研究[38]。但目前对于中医药延缓造血干细胞衰老的调控基因的认识仍不足，希望能进一步深入研究。