鱼类性腺发育研究进展

刘晨斌 ，徐革锋 ，黄天晴 ，谷伟 ，张玉勇 ，相福生 ，王炳谦

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025）

目前鱼类性腺发育的研究主要集中在原始性腺的形成和分化、精巢和卵巢的分化、不同发育阶段性腺形态特征与时相划分以及环境因素对于性腺发育的影响等[1]。本文通过综述近年来有关鱼类原始生殖细胞、性别分化和性腺发育的研究进展，以期为深度研究提供参考。

1 原始生殖细胞的起源、迁移和分化

原始生殖细胞（PGC）是鱼类生殖细胞的最初形式，在胚胎发育早期与体细胞分离，之后迁移到生殖原基，与周围上皮细胞相互作用形成原始性腺，最终在原始性腺中分化为配子细胞[2,3]。

1.1 鱼类PGC细胞的特征

掌握鱼类PGCs的外部和内部特征是研究其起源、迁移和分化的基础。鱼类PGC细胞呈梨形、卵圆形或圆形，体积较体细胞大，细胞直径在不同种属间差异较大，细胞核和细胞质界线明显；细胞核呈卵圆形或分叶状，体积大，核膜清晰，核仁明显，有1～2个核仁；细胞质呈弱酸性，核质比较高，细胞质染色较浅[4]。有些种类鱼的PGCs中还存在卵黄块，如在革胡子鲇[5,6]Clarias leather早期胚胎的PGCs细胞质中观察到了卵黄块。该物质随着胚胎发育而逐渐减少，直至消失。众多研究结果表明，鱼类发育成熟卵子的大小与PGCs的大小之间并没有明显联系[6-10]。

胚胎发育早期，鱼类PGCs具有独特的形态及显微结构。Saton[11]发现和描述了一种存PGCs细胞质内的电子致密物：无被膜包围，由原纤维组成网状结构，直接与线粒体外膜接触，与线粒体群联系紧密。刘少军[6]研究发现，革胡子鲇PGCs细胞质中也存在这种电子致密物。Hogan[12]不仅在青鳉Orizias latipes的PGCs中观察到了这种电子致密物，还发现了一种特殊的弯曲内质网结构，这种超微结构与细胞核膜相联系。对这种电子致密物的来源有两种解释：一种是因为在核孔周围发现了该物质的存在，所以认为这种电子致密物产生于细胞核内，而后经由核孔进入到细胞质当中；而另一种是因为线粒体与电子致密物相互联系，常同时出现，所以认为电子致密物的产生与其附近的线粒体有所关联[12]。除了上述研究以外，刘少军[6]发现，在革胡子鲇PGCs胞质中存在伸出的伪足；而Johnston[13]在大口黑鲈Micropterus Salmoides PGCs细胞质内也发现了丝状伪足。

1.2 鱼类原始生殖细胞的起源

早在20世纪初，在光学显微镜观察PGCs的组织学形态特征时，对PGCs的起源得出了两种观点：一种认为，鱼类PGCs起源于胚胎细胞的内胚层。如Hogan[12]在中华鲟Acipenser sinensis肠的内胚层鉴别出PGCs；刘少军[6]对革胡子鲇的研究发现，PGCs起源于原肠期早期的内胚层；宋卉等[9]在对泰山螭霖鱼Varicorhinus macrolepis的研究中观察到，PGCs最早出现在原肠早期靠近卵黄囊的内胚层中。另一种认为，鱼类PGCs起源于中胚层，如高书堂等[7]最早在泥鳅Misgurnus anguillicaudatus原肠晚期的中胚层发现了PGCs；Okkelberg[14]在普氏七鳃鳗Lampetra planeri的早期尾芽期侧板中胚层发现了PGCs。而 Hamaguchi等[15]研究发现，青鳉的 PGCs产生于内胚层和中胚层之间的区域；Shinomiya等[16]最早在青鳉原肠末期的胚盾中发现了PGCs。

研究技术的发展使对PGCs起源的研究也更深入。vasa基因作为第一个鱼类生殖细胞标记基因，在斑马鱼Barchydanio rerio var中的分离鉴定开创了鱼类生殖细胞研究的新篇章。对斑马鱼vasa基因的研究显示：PGCs最早出现在32细胞期，此时体细胞和生殖细胞分离成几簇，位于不同部位，在原肠期进入内胚层[17-20]。之后陆续在金鱼[21]Carassius auratus、泥鳅[22]和鲐鱼 Scomber japonicas[23]中发现这种模式，表明硬骨鱼类PGCs形成的普遍模式可能是先成论，但并非所有鱼类都适用这种模式，例如青鳉的PGCs形成模式并不符合先成论[24]，表明青鳉存在一种新的PGCs形成模式。

综合对不同物种的研究，人们认为PGCs的形成方式有两种：一种是先成论，认为母源性的生殖质决定PGCs的形成，在卵裂期的卵裂沟中可以检测到PGCs标记基因，随后PGCs标记基因定位在32细胞期的4个细胞中，这4个细胞之后分化为PGCs细胞[18]；另一种是后成论，认为PGCs是在胚胎发育的早期由其他细胞诱导形成，因为在早期胚胎中并未发现特异的生殖质[25]。

1.3 鱼类原始生殖细胞的迁移

在胚胎发育的早期，PGCs的起源位置离性腺体细胞组织相距较远，需要穿过各种体细胞组织到达生殖嵴。目前多数学者认为，鱼类在原肠胚之后，PGCs的迁移方式主要有3种：一是PGCs从内胚层进入脏壁中胚层之后到达肠系膜，再从肠系膜迁移到生殖嵴；二是PGCs到达生殖嵴途中经过体壁或体节中胚层；第三种是PGCs借助血液循环迁移到生殖嵴[26]。如细鳞大麻哈鱼Oncorhynchus gorbuscha胚肾小管中存在PGCs；在真骨鱼类肝脏中也发现了PGCs。这些研究结果表明，鱼类PGCs可以在除性腺外的其他器官中存在，并证实PGCs能借助血液循环迁移到生殖嵴[27]。

关于PGCs的迁移机制，一些学者认为是PGCs周围的组织细胞发生形态变化，细胞间相互作用，推动其被动迁移[28]；另一些学者在研究过程中发现PGCs能够伸出伪足，认为其通过伪足来主动迁移[6,13]。

2 鱼类性别的分化

鱼类性别主要由性染色体基因型决定，其性别决定类型多样。鱼类的性染色体决定类型主要有（1）XX/XY型，雌性为同配，雄性为异配，多数鱼类属于这种类型；（2）ZW/ZZ型，雄性为同配，雌性为异配；（3）ZO/ZZ与XX/XO型，前后分别为雌性和雄性配子异配，雌性或雄性缺少一条性染色体；（4）X1X1X2X2/X1X2Y型，复性染色体，Y染色体与常染色体发生了融合；（5）常染色体型，主要由常染色体决定性别[29]。大多数硬骨鱼类性腺的分化受遗传控制，但也存在一些种类受环境因子所控制。例如，近年来报道较多的温度影响鱼类性别表型的研究。温度影响性别比例有三种类型：第一种为高温使雄性增多，低温使雌性增多；第二种是高温产生较多雌性，低温产生较多雄性；第三种是在适宜的温度下，性别比例为1∶1，而在极限的高温或低温下雄性较多[30,31]。Baroiller等[32]发现，常温27℃下尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus雌雄比例为1∶1；受精后14～24d用36℃高温持续处理一段时间，其雄性比例上升到81%，而在34℃下处理，雄性比例增加效果不明显。

2.1 性腺分化时间

不同种的鱼类及性别之间，性腺分化时间差异较大，这与其发育规律和繁殖周期有关。例如，青鳉[15]性腺分化较早，在胚胎的孵化期就已完成；黑头呆鱼[33]Pimephales promelas在受精后10～25d卵巢解剖学开始分化；黑口新虾虎鱼[34]Round goby和非洲鲶[35]Clarias gariepinus的性腺在孵化后第15～30d完成分化；泥鳅[7]和革胡子鲇[6]的性腺分化时间在孵化后的40～60d；文鳊[36]Vimba的性腺在71日龄时开始分化；黑海鲻[37]Liza saliens孵出后2～3个月性腺分化；西伯利亚鲟[38]Acipenser baerii在7月龄时性腺开始分化；中华鲟[39]9月龄出现雌雄分化；黄颡鱼[40]Pelteobagrus fulvidraco卵巢分化早于精巢，13日龄卵巢开始分化，而精巢分化始于55日龄；泰山螭霖鱼[9]的卵巢分化开始于60日龄，而其精巢分化较卵巢晚，在70日龄时开始；半滑舌鳎[41]Cynoglossus semilaevis Gunther雌鱼在120日龄开始分化，而雄鱼则在150日龄；也有雄性分化早于雌性的，例如牙鲆[42]Paralichthys olivaceus卵巢在65日龄才开始分化，而精巢在50日龄就开始分化。

2.2 性腺分化标志

判断鱼类早期性腺分化方向的方法可分为形态学与细胞学两种。前者通过观察早期性腺组织的形态特征变化来判断，如卵巢腔和输精管的形成、微血管的分布、原始性腺体积大小以及生殖细胞数目等[43]。原始性腺开始出现卵巢腔可判断为向卵巢分化，而判断精巢分化主要依据输精管原基的出现，如半滑舌鳎[41]、黄颡鱼[40]和牙鲆[42]Paralichthys olivaceus泰山螭霖鱼[9]。而不同鱼类的卵巢腔形态特征、形成方式和时间不同。NaKamura等将卵巢腔的形成分为三种类型：第一种是在生殖腺的腹部和背部各形成一个组织突起，沿体壁侧面侧向延伸，一支向上，一支向下，最终这两个突起在侧面沿着一致的边缘融合形成卵巢腔；第二种是性腺腹部体腔膜形成组织突，延伸至背部，与背部的性腺延伸物融合形成卵巢腔；第三种是性腺侧壁向体腔背部延伸，延伸部分端部最终于背部体壁融合形成卵巢腔[44]。与上述三种类型不同，南方鲇[45]Silurus meridionalis在生殖腺腹面形成纵向组织突，向腹面延伸融合形成卵巢腔。

彼尔索夫对罗非鱼Oreochromis spp的研究发现，当微血管出现在生殖腺背部位置，生殖腺有向精巢发育的趋势；当微血管出现在生殖腺的中央位置，生殖腺有向卵巢发育的趋势[46]。有部分鱼类的雌性原始性腺体积比雄性大，如黑头软口鲦[47]Pimephales promelas，其性腺横切面积大的向着卵巢分化，横切面积小的向着精巢分化；半滑舌鳎雌性性腺的横切面积比雄性大，且形状不同。许多鱼类雌性的早期性腺中生殖细胞的数量比雄性多[41]，出现密集生长的生殖细胞群，可用这一特征来判断卵巢发育的开始，如虹鳟Oncorhynchus mykiss[48]。

判断鱼类早期性腺分化方向的细胞学方法以性原细胞的出现以及有丝分裂和减数分裂开始的时间作为依据[49]。向卵巢发育的性腺中，有丝分裂开始得早且快速，形成较多的生殖细胞，随后在短时间内开始减数分裂，其减数分裂开始的时间比向雄性发育的性腺早，如半滑舌鳎[41]。在鱼类早期个体发育中，生殖细胞在开始减数分裂阶段之前要经历较长一段时间，各个发育阶段生殖细胞的内含物、大小和体积变化很大[46,50]。如刘少军[6]对革胡子鲶的研究表明，PGCs所含生殖质多为颗粒状，则原始性腺向卵巢分化；如果多为线状，则原始性腺向精巢分化。

2.3 性腺分化类型

硬骨鱼类性腺分化方式复杂，总体分为三种类型：一是雌雄异体型，这种类型鱼类从早期性腺直接发育成精巢或卵巢，终生不变。这种类型在鱼类中最常见[51,52]；二是雌雄同体型，同时具有两性腺体，两性腺体同步或不同步行使功能；三是性逆转型，如黄鳝[53]Monopterus albus和石斑鱼[54]Epinephelus。

Yamamoto根据性别稳定性，将雌雄异体型又分为分化型和未分化型两种[55]。未分化型鱼类的原始性腺先发育成类卵巢样组织，然后一半左右的个体发育成雄性，其他的发育成雌性，例如斑马鱼[56]。更特殊的如七鳃鳗[57]Lampetra japonica的精巢80%左右是由原始性腺直接发育形成，其余的由卵巢样组织先退化再发育而来。分化型鱼类，其原始性腺直接发育成卵巢或精巢，例如银大马哈鱼[52]Oncorhynchus keta。分化型鱼类在自然情况下性逆转发生的可能性很小，两性鱼也很少存在，所以说分化型性别更稳定[55]。

2.4 性腺发育的分子调控机制

鱼类性腺的组织发生过程复杂，发育涉及众多的分子信号调控和信号通路和基因参与。

DMRT家族的dmy是第一个被确认的性别决定基因，与精巢分化相关，见于青鳉的Y染色体上[58]。在青鳉的演化过程中dmy出现较晚，故在其他鱼类中不存在[59]。斑马鱼中存在与sf-1同源的ff1d基因，可能调控参与精细胞增殖与分化的amh基因的表达，amh基因在精巢支持细胞上表达较高，而ff1d基因除了在精巢支持细胞外，在间质细胞中也有较高表达[60,61]。鱼类cyp19基因编码芳香化酶P450，其中cyp19a1直接参与卵巢发育，cyp19a2可能通过下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis,HPG轴）参与性别分化[62]。Zhou等获得了10多个与斜带石斑鱼Epinephelus coioides性反转有关的基因，其中sox3基因够调控卵子的发生[63]。Alam等[64]研究发现，蜂巢石斑鱼Epinephelus merra由雌转雄过程中，卵巢的降解与foxl2的下调有关。除与性别分化有关的基因外，还有一些与鱼类生殖细胞发育有关的基因，例如dnd基因与PGC的迁移有关，可以使用dnd morpholino干扰dnd基因的表达，使PGC迁移能力下降、凋亡，控制育性[65]。在对斑马鱼和狼鲈Dicentrarchus labrax等鱼类的研究中，发现多数鱼类的性别决定基因未充分特化，多个基因调控性别分化，性别分化分子机制呈现多样化[59]。

鱼类的性腺发育除受基因调控外，还受内分泌的影响，其中HPG轴起主导作用。丘脑分泌并释放的促性腺激素释放激素（GnRH），通过神经元到达垂体，使垂体合成促性腺激素（GtH）；促性腺激素通过血液进入性腺，生成性激素，调节性腺发育[59]。促黄体生成素（luteinizing hormone,LH）和促卵泡激素（follicle-stimulatinghormone,FSH）是促性腺激素的主要成员，分别受促黄体生成素释放激素（LH-RH）和促卵泡激素释放激素（FSH-RH）的调控[66]。LH和FSH的受体位于卵巢内颗粒细胞、卵泡膜细胞、精巢的支持细胞和间质细胞等细胞的细胞膜表面。细胞外液中的LH与FSH与靶器官细胞表面的受体结合，使α亚单位上的鸟苷二磷酸被鸟苷三磷酸替换，从βγ复合体上脱落，再与腺苷酸环化酶结合，催化腺苷三磷酸，产生cAMP。细胞内大量的cAMP能激活蛋白激酶A，调节细胞内蛋白的功能[66]。促性腺激素之间互相颉颃或是协同，也可以单独作用于性腺。例如FSH在LH的协同下促使卵泡细胞产生其他激素[66]。另一方面，性腺产生的性激素通过反馈调节GnRH的生成。还有些分子影响HPG轴具，调控性腺的发育。例如多巴胺具有抑制硬骨鱼GtH释放的功能[59]。随着分子生物技术的发展，对鱼类促性腺激素基因面的研究不断深入。此外还分析了促性腺激素在鱼类性腺发育各个阶段的表达。如GtH的受体在5日龄尼罗罗非鱼性腺发育中开始表达[67]；GtH随着大菱鲆Scophthalmus maximus卵巢发育从I期到V期过程中，表达逐渐增加[68]；黄鳍短须石首鱼Umbrina roncador在精子和卵黄发生期间FSH基因表达量高，而LH基因则是在精子排放期表达量高[69]。除了不同时期，鱼类促性腺激素在不同组织中的表达也不同。研究发现，GtH在对史氏鲟Acipenser schrenckii脑垂体中表达强烈，在性腺中也有强烈的表达，但低于脑垂体[70]。对鱼类促性腺激素功能的研究表明，缺乏高纯度的激素蛋白是一大障碍，但随着分子生物学的发展，基因工程技术帮助研究人员突破了这一障碍。构建了越来越多的鱼类促性腺激素基因重组表达体系，例如在大肠杆菌中构建的鲤Cyprinus carpio LH和FSH表达载体[71]；在毕赤酵母中构建的斑马鱼FSH表达载体[72]；在变形虫中构建的非洲鲶FSH和LH表达载体[73]。这些研究成果都为鱼类促性腺激素功能研究提供了理论依据。

3 硬骨鱼类性腺的发育

鱼类的生殖系统包括性腺（精巢、卵巢）和生殖导管（输卵管、输精管），其中性腺是生殖系统重要的组成部分。了解鱼类性腺的形态结构是研究鱼类性腺的发育基础。鱼类性腺发育的研究方法主要有组织学、组织化学和分子生物学等。

3.1 硬骨鱼类性腺的基本结构

硬骨鱼类性腺一般左右成对排列，悬系于鳔的腹面、腹腔两侧的腹腔系膜上。

3.1.1 精巢

硬骨鱼类精巢结构分为小管型和小叶型[58,75]。小叶型精巢由很多的精小叶构成，在精小叶中存在精小囊，精细胞在精小囊中发育成熟，之后从精小囊释放到小叶腔中，最终成熟精子存在于小叶腔和输精管中；小管型精巢不具有精小叶，精小管与中央腔相通，精小囊在精小管中逐渐发育并向输出管移动[75]。根据精小叶的排列方式将小叶型精巢分为辐射型和壶腹型[76]。在辐射型精巢中精小叶呈现规则的辐射状排列，而壶腹型精巢则是无规则的排列。

精小叶中的精原细胞通过有丝分裂形成精小囊，在精小囊的外层是支持细胞，生殖细胞在小囊内进行同步发育。精原细胞有丝分裂期间，先是无定向排列，之后多个精原细胞组合成不具有管腔的精细小管，类肌细胞排列在精细小管周围，形成精胞。精细小管的雏形是精胞，经过进一步发展，精胞转变为典型的精细小管。在精细小管中产生精子，精子汇集到壶腹腔内，壶腹腔起输精管和储精囊的作用。精小叶之间有成纤维细胞、间质细胞、淋巴管与血管[50]。

3.1.2 卵巢

根据有无卵巢腔和卵巢是否与输卵管相通，鱼类卵巢分为封闭卵巢和游离卵巢[77]。

游离卵巢的外围无卵巢腔，后端未形成输卵管，卵子成熟后突破滤泡膜进入体腔，再由泄殖孔释放到体外。游离卵巢被认为代表原始类型，卵巢属于这种类型的鱼类有圆口类、全头类、肺鱼类、硬鳞类等[77]。

硬骨鱼类多数为封闭卵巢，即腹膜形成的卵巢囊包围在卵巢周围。卵巢在体腔后端相遇，形成与泄殖孔相连的输卵管。卵巢壁由外层的腹膜和内层的白膜构成，从卵巢壁上向卵巢内部延伸出许多成束的板状结构。该板状结构由结缔组织、微血管和生殖上皮组成，称为产卵板。卵母细胞周围的滤泡细胞通过产生雌性激素，加快形成成熟卵子；当成熟卵子由滤泡层释放出来，遗留的滤泡细胞将组成黄体，由此产生孕酮[50]。

3.2 硬骨鱼类性腺发育分期

3.2.1 卵巢发育分期

对于卵巢的分期当前没有统一的标准，国内外学者在实际研究过程中采用较多的是Мeйeи[78]、施瑔芳[79]和刘筠[50]的卵巢分期标准，主要特征如下：

Ⅰ期性腺紧贴在鰾腹侧肠系膜两侧，呈淡肉色、透明线状，血管较少。性腺中主要是卵原细胞，细胞体积较小，核质比较大。

Ⅱ期卵巢变宽，呈肉红色，卵巢表面及组织内部密布微血管，卵巢中初级卵母细胞居多。

Ⅲ期卵巢随着发育，体积逐渐变大，变成较膨胀的囊状，呈青灰色，血管密布且清晰，肉眼可见卵粒，但不能分离。解剖学观察发现，此时的初级卵母细胞开始积累营养物质，细胞体积变大。

Ⅳ期卵巢接近成熟，积累了大量营养物质，体积继续增大，近乎充满整个体腔。血管发达，变粗，在卵巢膜上网状分布。卵母细胞基本完成了卵黄积累，细胞体积显著增大。

Ⅴ期卵巢体积达到最大，卵子成熟，呈青灰色松软状，卵巢壁变薄，滤泡膜破裂，卵母细胞释放到腹腔，卵子呈圆形，处于游离状态，通过轻压鱼体腹部和提起鱼体，卵子可以从泄殖孔流出。

Ⅵ期卵巢体积缩小呈松散状，表面密布血管，呈紫红色。只产卵一次的类型，产后卵巢萎缩，卵巢内残留的卵母细胞、卵粒被吸收；多次产卵的类型，卵巢退化到Ⅲ期。

3.2.2 精巢发育分期

目前，国内外学者对于精巢的发育分期观点不同，尚无统一标准。我国大多数学者依据精巢发育的解剖学、细胞学特征，将精巢的发育分为6个时期[50]。

Ⅰ期精巢成对的紧贴于腹腔两侧，呈透明细线状，经过组织学观察，可以看到精原细胞无规律分散在结缔组织间。

Ⅱ期精巢呈半透明细线状，较扁，血管不明显，颜色稍淡，肉眼可以区别精巢和卵巢（具产卵板）。增多的精原细胞成束排列组成壶腹的雏形。

Ⅲ期精巢呈淡红色圆棒状，血管广泛分布。壶腹中央出现管腔，在壶腹中以初级精母细胞为主，精原细胞占少数。

Ⅳ期精巢进一步发育，体积增大，呈灰白色袋状，血管分部明显。在壶腹中出现不同发育阶段的精细胞，这些精细胞在精小囊中同步发育。

Ⅴ期精巢呈乳白色块状，血管进一步发育，分部更加明显，精巢饱满，达到完全成熟。成熟精子充满了精细小管和壶腹腔。提起鱼体或轻压鱼腹，精液从泄殖孔流出。

Ⅵ期精巢为退化或排精后精巢，其体积减小、萎缩，呈弱红色。壶腹中仅剩结缔组织、精原细胞和少量初级精母细胞，管腔中尚存少量退化的精子。

3.3 硬骨鱼类配子发生

3.3.1 精子发生

鱼类精子发生经过增殖、生长、成熟和变态四个时期，精原细胞经过这个过程，发育到成熟精子。精原细胞发育到成熟精子需经历精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子5个主要阶段[80]。在增殖期，精原细胞经过不断地有丝分裂，产生A型和B型两种精原细胞，其中B型在后期开始分化，A型则保持分裂能力；在生长期，B型精原细胞停止有丝分裂，开始为后期成熟分裂吸收和储备营养物质，复制DNA，原生质增多，细胞变大；在成熟期，初级精母细胞完成物质积累，开始向精子细胞转化，先是通过第一次减数分裂转化为次级精母细胞，之后再经过第二次减数分裂分化形成精子细胞，染色体数减半。在变态期，精子细胞经过核、质分化和重组，产生成熟的精子[77]。

3.3.2 卵子发生

鱼类的卵子发生分为增殖、生长及成熟三个时期。随着卵巢发育，可以观察到不同发育阶段的卵细胞。对于卵母细胞发育阶段的划分，国内外意见不同，目前还没有统一的标准。国内外学者习惯根据卵细胞大小、体积、卵黄和滤泡发育等特征，将卵细胞发育分为六个时相，这种方法既体现了卵细胞发育的本质区别，又结合了卵巢发育分期特征[50]。

Ⅰ时相卵原细胞进行多次有丝分裂，染色质交会，之后停止分裂向初级卵母细胞转变。此阶段细胞体积小，细胞质少，细胞核大，呈椭圆形，核内细丝状的染色质成网状结构。频繁分裂的卵原细胞，形成细胞团。

Ⅱ时相进入初级卵母细胞小生长阶段，细胞核和细胞质增加，体积增大，在核旁的细胞质中出现卵黄核。细胞核体积变大，呈卵圆形，多个核仁排列在核膜内壁。滤泡细胞在卵母细胞外先是形成稀疏的滤泡膜，之后随着滤泡细胞的增多，滤泡膜逐渐完整。

Ⅲ时相初级卵母细胞由小生长阶段进入大生长阶段。在质膜的外侧，滤泡膜由单层增为双层，在滤泡膜和卵细胞膜之间形成放射膜。随着卵黄和脂肪的积累，卵母细胞体积显著增加，在细胞质内靠近细胞膜处出现液泡，液泡随着卵细胞的生长不断发育，数目增加，卵黄沉积，在液泡间形成卵黄颗粒。

Ⅳ时相进入初级卵母细胞的发育晚期。核外空间几乎被卵黄充满，细胞质被挤到核的周围以及细胞膜边缘。中央的细胞核开始偏向动物极受精孔下方，细胞质也随之向受精孔移动，最终进入原生质盘内。滤泡膜和放射膜变得更加明显。

Ⅴ时相初级卵母细胞在释放第一极体之后，完成第一次减数分裂，转变为次级卵母细胞，处于第二次减数分裂中期，细胞核向成熟方向发展。核膜溶解，细胞核变形，出现染色体。细胞质中的卵黄颗粒逐渐融合成块状。卵黄与原生质发生极化现象。成熟卵母细胞脱离滤泡膜，进入卵巢腔，成为游离卵。

Ⅵ时相为停留在卵巢腔中的未排出卵子，并逐渐进入生理死亡或自然退化的卵母细胞。卵黄颗粒变为液态，呈块状，颜色昏暗，放射膜明显增厚。

4 展望

随着技术的进步，在斑马鱼中得到分离、鉴定了第一个鱼类生殖细胞标记基因vasa[20]，为鱼类生殖细胞的研究开创了新纪元。目前，被分离鉴定的鱼类生殖细胞标记基因日益增多，随之关于PGCs的研究和利用日益增多。研究表明，利用供体生物得到的生殖细胞，移植到受体生物中，可以产生生殖系嵌合体，之后产生来自供体的配子或后代，这项技术称为生殖细胞移植技术（germ celltransplantation,GCT）[81]。随着研究的深入，这种技术的应用前景十分广阔，不仅可应用于研究转基因和干细胞生物学特性，还对鱼类的苗种繁育、濒危鱼种的保护以及鱼类性别选择育种等具有重要意义。目前已在部分鱼种中成功移植，相信随着研究的深入，这项技术会在更多种鱼类中得到应用。