高效液相色谱测定乳制品中黄曲霉毒素M1

□ 朱丹倩 陶志成 孔玉婷 姚菲菲 浙江赞宇科技股份有限公司 浙江金正检测有限公司

AFM1是哺乳动物摄入被黄曲霉毒素 B1（Af latoxin B1，AFB1）污染的饲料后通过在体内经羟基化作用转化成的代谢产物。AFM1对光、热和酸都非常稳定，主要存在于动物的可食部分，如牛奶、肝、蛋类等，其中以牛奶最为常见，是目前发现的毒性、致癌性极强的天然有毒物，它能够对人及动物的肝脏组织产生破坏，严重时会导致肝癌甚至死亡。由于牛乳及其乳制品是人类（尤其是婴幼儿）的主要食品，乳制品营养丰富，能够增强人体免疫力，受到很多国家的重视。因此建立简便快捷高效的检测方法十分重要。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260超高效液相色谱仪（配荧光检测器）（美国Agilent公司）；3-18KS高速冷冻离心机（德国Sartorius公司）；纯水净化仪（杭州永洁达净化科技有限公司）；ME3basic振荡器（IKA公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯（美国大地公司）；吡啶鎓三溴化物（上海安谱实验科技股份有限公司）；免疫亲和柱（北京安易世纪贸易有限公司）；黄曲霉毒素M1标准品（o2si smart solutions公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

黄曲霉毒素M1标准溶液移取至10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度。此溶液密封后避光4 ℃下保存。按需要用初始比例的流动相稀释成适当浓度的混合标准工作液，现配现用[1]。

1.2.2 色谱条件

赛默飞 C18（4.6 μm×250 mm）色谱柱；柱温35 ℃；流速1 mL/min（衍生剂：0.3 mL/min），进样量50 μL；流动相为甲醇∶水=54∶46（V∶V）。荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长440 nm。

1.2.3 提取方法

称取5 g混合均匀的试样于50 mL离心管中（乳粉、特殊膳食等加入热水,涡旋混匀）。加入10 mL甲醇，涡旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下离心10 min，将适量上清液或滤液转移至烧杯中，加40 mL水备用。将上述样液移过免疫亲和柱。收集全部洗脱液。在50 ℃下氮气缓缓地将洗脱液吹至1 mL以下，用水定容至1.0 mL，涡旋30 s混匀，0.22 μm 滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

选取赛默飞C18色谱柱（4.6μm×250 mm），对乙腈、甲醇、水等流动及衍生剂相进行组合，考察其保留时间、灵敏度及峰形，选取最优的流动相体系。本试验使用甲醇代替乙腈可有效降低检测成本。本试验将方法优化为流动相：甲醇∶水=54∶46（V∶V），流速为1 mL/min，吡啶鎓三溴化物为衍生剂0.3 mL/min，明显提高了灵敏度，且方便与黄曲霉毒素B族一同检测[2]。

2.2 提取条件选择

本试验采用AFM1免疫亲和柱作为样品前处理方法，该方法能够从复杂基质中富集极低浓度的目标化合物，并具有极高的选择性。洗脱时使用2 mL甲醇可以充分将待测物洗脱，氮吹至1 mL以下直接加水稀释至1 mL减轻溶剂效应，避免损失，操作简便，提高了检测效率。

2.3 方法线性关系、精密度和检出限

黄曲霉毒素M1在0.1～20 ng/mL范围内线性良好，相关系数大于0.999，不同阴性样品基质中在3个浓度水平加标试验回收率在83.6% ～94.2，相对标准偏差（RSD）为3.68%，方法检测限（LOD，S/N≥3）为0.02 μg/kg。本方法简便快速，重现性好，灵敏度高，结果可靠。

3 讨论

本文建立了高效液相色谱测定乳制品中黄曲霉毒素M1的方法。试样中的黄曲霉毒素M1用甲醇-水溶液提取，上清液稀释后，经免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩后经液相色谱分离检测。与目前的国家标准和文献报道的方法相比，本方法在保证准确性好的同时，尽可能地提高了灵敏度，为测定食品中黄曲霉毒素M1的研究提供了数据和基础。