脑出血与自噬相关性的研究进展

2019-01-05

中西医结合心脑血管病杂志 2019年13期

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)占全部脑卒中的10%～15%[1-2]，具有发病率、病死率、致残率高的特点，约40%的存活病人遗留残疾[3]，给病人家庭及生活造成了沉重的负担。自噬是通过溶酶体降解从而实现自我吞噬的过程，50多年前美国科学家Ashford和Porter通过电子显微镜(electron microscope，EM)在大鼠肝脏细胞中观察到这一现象[4]。人们在最近几年才逐渐认识到自噬在生理机制或者病理状态下的重要功能。自噬在神经系统退行性疾病中的作用已经由大量研究来阐释。近年来，自噬对发病率和死亡率均高的脑血管疾病的研究才逐步开展起来，目前已经明确自噬在实验性脑出血[5]、缺血性卒中[6]、蛛网膜下腔出血[7]的神经元胶质细胞中都显著激活。

1 自噬的形成及分类

在起始信号(饥饿等)的调控下，即将发生自噬的细胞胞浆中出现大量游离的杯状双层膜结构，即自噬前体；自噬前体的双层膜结构在一些自噬相关蛋白的辅助下不断延伸。微管相关蛋白1轻链3 (MAPl -LC3 Ⅱ)是一种对自噬前体延伸起关键调节作用的蛋白，在延伸的过程中不断被募集到自噬前体上。然后，自噬前体包裹自噬的底物，如变性坏死的细胞器和部分胞浆，并最终形成闭合的自噬泡或自噬小体[8]；成熟的自噬小体到达溶酶体，自噬小体外膜和溶酶体膜相融合进入溶酶体腔，并在其水解酶的作用下将其包裹的底物降解。自噬小体的形成是鉴定自噬现象的关键。在高分辨率透射电镜(high resolution transmission EM，HR-TEM)下观察到自噬小体直径的范围一般为500～1 500 nm，其双层膜的起源尚不清楚，说法不一，不同的研究显示自噬泡的膜来源于不同的细胞内结构[9]。

根据细胞内底物被转运到溶酶体的方式，自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[10]。通常所说的自噬大多是指巨自噬，由其双层膜结构包裹细胞内容物后再与溶酶体融合；微自噬是细胞内容物通过溶酶体膜的自身变形内陷而被吞噬的过程；分子伴侣介导的自噬具有高度选择性，由分子伴侣识别带有特定序列的蛋白底物，再与溶酶体进行融合。尽管这3种自噬的方式不相同，但最终都与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，最终被其消化、降解。

2 自噬的机制概述

自噬的产生是由多条信号通路共同介导来完成的，它们错综复杂，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、活性氧(ROS)等是多条信号通路的交叉点，是调控自噬的关键因素。由此可见，明确阐述自噬的生理病理机制，有助于诱导自噬在疾病的发生发展过程中发挥保护作用。

2.1 mTOR信号通路 mTOR是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)蛋白激酶类家族。mTOR通路是调节自噬的主要信号通路，它可接受多种信号的刺激，在细胞生长、增殖、凋亡和自噬过程中起着非常重要的作用，是自噬的负调控因子。mTOR存在两种不同的形式，对雷帕霉素敏感的复合物mTORC1，主要调节细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡、能量代谢以及自噬；对于雷帕霉素不敏感的复合物mTORC2，其主要功能是参与细胞骨架的重组和细胞的存活。TOR是雷帕霉素的蛋白质靶标，雷帕霉素是通过抑制mTOR的活性，从而发挥抑制p70S6的活性，诱导自噬发生[11-12]。在营养丰富的条件下，TOR激酶与Atg1结合使其磷酸化直接抑制自噬的下游信号；反之，在饥饿条件下，TOR激酶的活性被抑制，Atg1去磷酸化，Atg1激酶激活，从而诱导自噬的发生。

2.2 PI3K/Akt信号通路 PI3K是一种可使肌醇环第3位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶，依其结构可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型PI3K激活可抑制细胞自噬：Ⅱ型PI3K与自噬关系不大；Ⅲ型PI3K激活可促进细胞自噬。目前研究较广泛的是能被细胞表面受体活化的Ⅰ型PI3K[13-14]。Akt是PI3K-Akt信号转导通路关键分子之一，激活后并被磷酸化的Akt可影响下游多种分子活性，并能磷酸化p27—细胞周期调控因子，而p27可作用于细胞周期蛋白(cyclin)/cyclin激酶(CDK)，从而激活CDK活性以促进细胞增殖[15]。有研究表明，咖啡因可通过抑制PI3K/Akt信号转导通路相关蛋白的表达促进细胞自噬，进而导致细胞凋亡，即自噬性程序性细胞死亡[16]。

2.3 ROS信号通路 ROS是一类化学性质活泼、有较高氧化活性的分子和离子的总称。以往认为，ROS是指一类对细胞有损伤的毒性物质，而近年的研究表明，其作为一种重要的信号分子，参与细胞增殖、分化、凋亡、自噬等多个生理过程，尤其是线粒体来源的ROS，在自噬发生过程中发挥重要作用[17-18]。神经生长因子(NUF)缺陷时，大量ROS在神经元线粒体内蓄积，可引起线粒体膜脂质过氧化，导致线粒体功能异常，进而激活自噬；自噬激活又可通过降解过氧化氢酶反过来增加细胞内ROS水平，最终引起自噬性细胞死亡。这是ROS首次被证实作为重要信号分子参与自噬性细胞凋亡[18]。ROS可介导自噬发生，自噬激活又可反过来加剧ROS蓄积。低水平的ROS可激活自噬，自噬激活后可通过降解过氧化氢酶增加ROS水平，ROS表达增加又可进一步激活自噬。这种正反馈效应放大了ROS对自噬的介导作用。然而，在自噬调节过程中ROS具体的分子参与尚未明确。

另外，除以上信号通路外，还有其他分子信号通路，例如核转录因子(NF-κB)、Beclin-1、Ras/蛋白激酶A(PKA)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信号转导通路也与自噬发生密切相关。

3 自噬的生理作用

3.1 清洁作用自噬是细胞中一些需要降解的蛋白质和细胞器被亚细胞膜结构包裹并最终转运至溶酶体降解和再循环的过程。在此期间，产生的氨基酸和其他小分子物质或能量可以被细胞重复利用，自噬是从细胞中去除多余的蛋白质和细胞器的过程，在维持细胞代谢平衡方面发挥着重要作用[19]。

3.2 免疫调节近年研究系显示，自噬作用不仅能清除病原体，还能参与免疫调节。自噬与瓜氨酸蛋白质特异性结合，可能是造成类风湿性关节炎病人自身免疫失调的因素[20]。在多态性自噬基因中，发现Atg1同源物ULK1与Crohn病有一定的相关性[21]。自噬与免疫疾病分析中，证实了免疫相关酶GTP酶M(IRGM)与系统性红斑狼疮的相关性[22]。这些基因研究和相关证据均提示自噬在自身免疫性疾病中发挥着重要作用。

3.3 调节衰老衰老是细胞清除代谢废物的功能降低的一种状态，导致受损的蛋白质和细胞器逐渐积累，使生命体的生存能力低下。研究表明，巨自噬与分子伴侣介导自噬的水平在哺乳动物衰老过程中明显下降[23]，尤其可以影响巨自噬对功能缺陷线粒体的降解[24]，同时由于衰老而下调的自噬水平，进一步导致各老化器官功能的降低[25]。

4 脑出血后血肿的形成及意义

因为脑出血后，由进入脑组织血液形成的血肿是早期脑组织机械性压迫和继发神经功能损伤加重的始动因素，所以及时有效地清除血肿成为治疗脑出血的关键环节[26]。国内有研究认为，基底节区尤其是丘脑部位的出血容易发生血肿扩大[27]。一般认为，血肿扩大的高发时间是发病后<6 h，少数发生在6～24 h，>24 h几乎不再出现血肿扩大[28]。Silva等[29]研究发现早期血肿扩大病人的神经功能损害比血肿未扩大的病人要加重3.7倍，3个月死亡率增加5.2倍。STICH临床试验证实：近年来通过外科手术清除血肿以治疗脑出血并未取得预期的效果。试验显示，脑出血早期手术治疗和保守治疗的临床结果无显著差异[30]。原因可能与现有手术方法不能完全清除血肿，残留于脑组织的血肿仍可导致继发性神经损伤有关。近几年研究显示，脑出血后机体具有自发吸收清除血肿的能力，并且病人临床结局与血肿吸收速度的快慢呈正相关[31-32]。因此，在外科血肿清除无效的情况下，促进内源性血肿吸收成为治疗脑出血的新途径[33-34]。

5 脑出血后血肿内引起脑组织损伤的成分

红细胞及其降解产物是血肿内引起脑组织损伤的主要成分。ICH后，红细胞破裂使大量血红蛋白(hemoglobin，Hb)暴露于细胞外，亚铁血红蛋白可自发氧化为高铁血红蛋白过氧化物，继续氧化生成血红素(heme)，血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)作用下氧化生成胆绿素和铁离子，前者对脑组织有毒害作用，后者是毒性作用较强的自由基，胆绿素则很快被还原成胆红素，这些代谢产物均会对脑组织产生毒性[35-36]；凝血酶原活化转化成凝血酶，可将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，是血液凝固的关键因子。Zain等[37]发现组织中低浓度的凝血酶具有细胞保护作用，而高浓度时却具有细胞毒性。凝血酶造成脑水肿的机制：可能是凝血酶作用于细胞毒性受体作用，直接产生细胞毒性作用。因此，抑制红细胞降解、减轻或避免红细胞降解产物及细胞毒性物质对脑组织的毒性作用，是降低神经功能损害的关键一步。

6 脑出血后血肿内源性清除机制

6.1 红细胞的内源性清除机制脑出血后血肿的形成及降解可导致小胶质细胞激活。在脑出血的早期，小胶质细胞可以通过吞噬红细胞及红细胞裂解成分来清除血肿。小胶质细胞发挥吞噬功能主要由CD36介导完成。CD36是脑组织的清道夫受体之一，它是一种膜糖蛋白，其在颅内可在神经细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞等表达，并具有相应的不同功能。近年有研究显示，在体外和体内脑出血模型中，给予PPAR-γ活化剂如罗格列酮及15-deoxy-前列腺素J2(15d-PGJ2)治疗，增加了小胶质细胞/巨噬细胞CD36的表达，并增强了它们吞噬红细胞的能力，提示促进CD36表达可以加快血肿的吸收[34-35]。CD47是免疫球蛋白(Ig)超家族中的重要成员之一，为整合素相关蛋白。脑出血后，红细胞上的CD47与巨噬细胞表面的抑制性受体相结合，抑制小胶质细胞/巨噬细胞吞噬红细胞。在小鼠脑出血模型中，相比于正常组，CD47基因敲除组的血肿清除速度较快，神经功能缺损较轻[38]。然而，激活的小胶质细胞对脑损伤来说是有益的还是有害的，取决于小胶质细胞激活的程度和持续时间以及其作用时间点等相关因素[39-40]。

6.2 降解产物内源性清除机制脑出血后，大量游离Hb进入脑实质内，与结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)结合形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物(hemoglobin-haptoglobin complex，Hb-Hp)，其能被CD163(单核巨噬细胞血红蛋白清道夫受体)特异性识别，经吞噬细胞的内吞作用清除，以减少相关的毒性作用[41-42]。游离的Hb在ROS的作用下氧化成MetHb，由于其具有不稳定性可迅速释放游离血红素，血红素结合蛋白(HX)可抑制血红素的氧化能力并通过与巨噬细胞受体CD91结合介导血红素的运输[43]。血红素在HO作用下氧化生成铁离子，而铁螯合剂对铁离子有极高的特异性亲和力，将铁离子包含在螯合剂内部，形成铁离子复合物并促进其排泄，以此减轻铁离子的病理性沉积和铁超载[44]，在体内亦有很多内源性铁螯合剂，如抗坏血酸、铁蛋白、转铁蛋白、三磷酸腺苷(ATP)、糖等，但是目前尚缺乏对内源性铁清除机制的相关报道。

7 脑出血后自噬的激活

2008年，He等[5]利用EM在血肿周边的组织细胞内观察到大量双层膜的自噬小体结构，证实了在脑出血发生后自噬的激活。而已有研究证实，血肿释放的过量铁离子和凝血酶则是诱发自噬的主要原因，亦是导致脑出血后血肿周边组织损伤的两个主要因素。

7.1 铁超载脑出血后铁离子的产生主要来自两个方面：一方面红细胞裂解最终氧化成铁离子；另一方面脑出血后血脑屏障破坏，通透性增加，高浓度的非运铁蛋白铁进入到富含脂质的神经元的周围环境中，引起铁离子异常积聚。研究显示：实验大鼠接受氯化亚铁的基底节直接注射3 d和7 d后，相比于对照组，去铁敏治疗组则可有效降低脑出血后LC3-Ⅱ蛋白和Cathepsin D的水平，故脑出血后血肿周围细胞自噬的激活可能是铁超载导致[45]。

7.2 凝血酶凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，为内、外源性凝血级联反应中的一个重要组成部分。脑出血后引起凝血酶的快速大量表达。2011年，Hu等[46]利用大剂量凝血酶进行大鼠基底节注射3 d和7 d后，在EM下亦观察到了自噬激活，说明凝血酶也是脑出血后自噬激活的重要因素。

8 脑出血后自噬相关蛋白的表达

8.1 Cathepsin D 它是介导自噬过程的重要蛋白，研究证实Cathepsin D能介导自噬，Cathepsin D的表达对自噬泡的形成有正向调节作用[47]。在脑出血研究中，He等[5]在脑出血大鼠模型中发现，脑内注射自体血或离子铁后LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换、Cathepsin D的表达增加；Gong等[48]发现老龄大鼠脑出血后Cathepsin D表达增加，加重自噬和神经功能缺损；Hu等[46]发现脑出血后，凝血酶能增加LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换和Cathepsin D的表达上调。由此可见，Cathepsin D表达量的改变可能由自噬引发并可能导致神经细胞功能改变，是自噬活性的评定指标之一。

8.2 LC3与Beclin-1 LC3是酵母Atg8基因在哺乳动物中的同源物，以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式在细胞内存在，是检测自噬的标志蛋白[49]。Beclin-1是酵母Atg6基因在哺乳动物中的同源物，含有450个氨基酸，是自噬激活的正向调节因子[50]。有研究发现，自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在脑出血后表达升高，24 h即达高峰，且高表达持续至7 d，说明脑出血后有自噬的过度激活，导致神经细胞发生程序性细胞死亡，进而引发多种继发性脑损伤[51]。